Причины возникновения зпр: Причины возникновения задержки психического развития

Содержание

Причины возникновения задержки психического развития

Выделяют 4 основных типа ЗПР:

конституционального характера;
соматогенного характера;
психогенного характера;
церебрально-органического характера.

ЗПР конституционального происхождения

При этом виде задержки психического развития эмоционально-волевая сфера ребенка находится на более раннем этапе физического и психического становления. Наблюдается преобладание игровой мотивации поведения, поверхностность представлений, легкая внушаемость. У таких детей даже при обучении в общеобразовательной школе сохраняется приоритет игровых интересов. При этой форме ЗПР гармонический инфантилизм можно считать главной формой психического инфантилизма, при которой наиболее ярко выражено недоразвитие в эмоционально-волевой сфере. Ученые отмечают, что гармонический инфантилизм нередко можно встретить у близнецов, это может указывать на связь данной патологии с развитием многоплодности. Обучение детей с данным типом ЗПР должно происходить в специальной коррекционной школе.

ЗПР соматогенного происхождения

Причинами данного типа задержки психического развития являются различные хронические заболевания, инфекции, детские неврозы, врожденные и приобретенные пороки развития соматической системы. При этой форме ЗПР у детей может присутствовать стойкое астеническое проявление, которое снижает не только физический статус, но и психологическое равновесие ребенка. Детям присуща боязливость, стеснительность, неуверенность в себе. Дети этой категории ЗПР мало общаются со сверстниками из-за опеки родителей, которые стараются оградить своих детей от лишнего, на их взгляд, общения, поэтому у них занижен порог межличностных связей. При этом виде ЗПР дети нуждаются в лечении в специальных санаториях. Дальнейшее становление и обучение этих детей зависит от их состояния здоровья.

ЗПР психогенного характера

Центральным ядром данной формы задержки психического развития является семейное неблагополучие (неблагополучная или неполная семья, различного рода психические травмы). Если с раннего возраста на психику ребенка оказывалось травмирующее влияние неблагоприятных социальных условий, то это может привести к серьезному нарушению в нервно-психической деятельности ребенка и, как следствие, к сдвигам вегетативних функций, а следом и психических. В этом случае можно говорить об аномалии в развитии личности. Данную форму ЗПР нужно правильно дифференцировать от педагогической запущенности, которая патологическим состоянием не характеризуется, а возникает на фоне недостатка знаний, умений и интеллектуального недоразвития.

ЗПР церебрально-органического происхождения

Этот тип задержки психического развития встречается чаще других. Часто обладает яркостью и стойкостью нарушений в эмоционально-волевой сфере и познавательной деятельности ребенка. У этой категории детей преобладает наличие негрубой органической недостаточности нервной системы. На этот вид ЗПР могут оказать свое патологическое влияние токсикозы беременных, инфекционные заболевания, травмы, резус-конфликт и т.п. Дети с этим видом ЗПР характеризуются эмоционально-волевой незрелостью.

Материал подготовила Михно А.В. педагог-психолог

высшей квалификационной категории

МБОУ ЦДК «Детство» г. Краснодара

Причины возникновения ЗПР у детей

Виктория Ефимова, кандидат педагогических наук, психофизиолог, логопед, руководитель центра «Логопрогноз» (Санкт-Петербург)

Что такое ЗПР?

Термин задержка психического развития (ЗПР) широко используется в отечественной научной литературе с середины 60-х годов ХХ века. Но за это время смысл, который вкладывали специалисты в этот диагноз, многократно менялся. Сейчас в категорию ЗПР попадают самые разные дети только по одному признаку: их развитие существенно отстает от большинства сверстников во всех или нескольких областях познавательной деятельности.

Почему происходит это отставание? Причин может быть очень много и большинство из них связаны с нарушениями в работе нервной системы, которые могли возникнуть еще до рождения. В группе риска оказываются дети, которые родились в результате тяжелых родов, перенесли гипоксию во время внутриутробного периода жизни или в родах, много болели в младенческом возрасте, а также недоношенные дети.

Почему ЗПР возникает не у всех детей из группы риска?

Вот что интересно: все дети, на которых воздействовали вредоносные факторы, находятся в группе риска, но ЗПР возникает не у всех. Почему такая разница? Дело в том, что мозг ребенка – это всегда незаконченный проект. Внутренние связи в мозге любого ребенка активно развиваются под воздействием опыта. А то, какой это будет опыт, зависит от нас – взрослых.

Многие признаки ЗПР можно преодолеть просто общаясь и играя с ребенком – это отличная пища для развития мозга. Часто ЗПР является результатом недостатка общения, если с ребенком находился взрослый, который только кормил, мыл и укладывал спать.

Иногда признаки ЗПР у ребенка замечают очень поздно: в возрасте 5 – 6 лет, когда исчезают надежды на то, что он до школы догонит ровесников без посторонней помощи.

Какие дидактические игры и пособия мы рекомендуем для игр и занятий с детьми с задержкой развития, которым необходимо до школы наверстать упущенное?

Математические игры для ребенка с ЗПР

1,2,3,4,5 — ребенок освоил порядковый счет? Но это не означает, что он готов к изучению математики. Часто у детей с ЗПР действия с цифрами (символами) вызывают большие затруднения. Трудности с освоением состава числа могут мешать ребенку много лет. Что делать? Вернуться на шаг назад и поработать с предметами, которые можно взять в руки, пересчитать и «прожить» все математические понятия.

Вот такие математические весы от компании Learning Resources помогут организовать эффективные и интересные занятия. Мишки сделаны из тяжелого качественного пластика, их очень приятно держать в руках. Ребенок сможет опытным путем выяснить что значит: больше, меньше, равно.

Игры для развития внимания для детей с ЗПР

Дефицит внимания – еще одна распространенная проблема ребенка с ЗПР. Поэтому продолжительные по времени игры быстро надоедают. Игры со сложными правилами тоже вряд ли придутся по душе ребенку с задержкой развития.

Динамичная игра Доббль может быть очень короткой, она тренирует внимание, наблюдательность и быстроту реакции. Совершенно не обязательно устраивать соревнование, на первом этапе можно давать ребенку время подумать. Суть игры заключается в том, что нужно найти сходство между своей карточкой и карточкой, которую положили на стол. Тот, кто заметил сходство первым, забирает карточку себе.

Развитие речи у ребенка с ЗПР

Иногда на первый взгляд речевое развитие ребенка с ЗПР может показаться достаточно благополучным. Он выполняет все задания и охотно отвечает на вопросы педагога. Трудности могут возникать с оформлением своих мыслей в виде высказывания или монолога – с инициативной речью. Вот такие кубики, которые можно использовать не только на занятиях, но и брать с собой в любые поездки, помогут развитию связной речи ребенка с ЗПР. Что с ними делать?

Самое эффективное задание: давай с тобой придумывать историю по очереди. Я начну (взрослый выбирает любой кубик, например, кошка): Жила-была черная кошка. Однажды она гуляла по городу и встретила…. Теперь твоя очередь, выбирай кубик.

Развитие мелкой моторики у ребенка с ЗПР

На самом деле игра, о которой я хочу рассказать дальше многофункциональна. Она развивает не только мелкую моторику. Кстати, очень редко следует начинать именно с развития мелкой моторики, так как сначала ребенок должен научиться управлять крупными движениями.

Итак, перед вами набор Мини Билибо – это уникальный конструктор для создания дидактических игр. Возможно вы уже видели балансиры – черепашки такой же формы, в которых можно крутить ребенка, стимулируя вестибулярную систему.

Форма Мини Билибо такая же, но размеры поменьше – можно взять в руку. В наборе разноцветные билибо, кубик со сменными гранями и 36 цветных плоских фишек. Что можно делать? Бросать и ловить, попадать в цель, изучать цвета, играть в игру «что пропало», сортировать, носить билибо на голове, удерживая равновесие. Можно придумать игру для ребенка любого возраста и решать самые разные дидактические задачи. Целый методический кабинет в одной коробочке!

Классификация ЗПР (по Лебединской К.С.) -Методическое пространство -Начальная школа -Методические рекомендации -Меню

Классификация ЗПР (по Лебединской К.С.)

Конституционального происхождения – состояние задержки определяется наследственностью семейной конституции. В своем замедленном темпе развития ребенок, как бы повторяет жизненный сценарий отца и матери. К поступлению в школу у этих детей наблюдается несоответствие психического возраста его паспортному возрасту, у семилетнего ребенка он может быть соотнесен с детьми 4 – 5 лет. Для детей с конституциональной задержкой характерен благоприятный прогноз развития при условии целенаправленного педагогического воздействия (доступных ребенку занятий в игровой форме, положительном контакте с учителем). Такие дети компенсируются к 10-12 годам. Особое внимание необходимо уделить на развитие эмоционально-волевой сферы.

Соматогенного происхождения – длительные хронические заболевания, стойкие астении (нервно-психическая слабость клеток головного мозга) приводят к ЗПР. Такие дети рождаются у здоровых родителей, а задержка развития – следствие перенесенных в раннем детстве заболеваний: хронические инфекции, аллергии и т.д. У всех детей с данной формой ЗПР имеет место выраженные астенические симптомы в виде головной боли, повышенной утомляемости, снижение работоспособности, на этом фоне расстройство, переживание, внимание снижается, память и интеллектуальное напряжение удерживается на очень короткое время. Эмоционально-волевая сфера отличается незрелостью при относительно сохраненном интеллекте. В состоянии работоспособности могут усваивать учебный материал. В упадок работоспособности могут отказаться от работы. Склонны фиксировать внимание на своем самочувствии и могут воспользоваться этими способностями для того, чтобы избежать трудностей. Испытывают трудности в адаптации к новой среде. Дети с соматогенной ЗПР нуждаются в систематической психолого-педагогической помощи.

ЗПР психогенного происхождения. Дети этой группы имеют нормальное физическое развитие, функционально полноценные мозговые системы, соматически здоровы. Задержка психического развития психогенного происхождения связана с неблагоприятными условиями воспитания, вызывающими нарушение формирования личности ребенка. Эти условия – безнадзорность, часто сочетающаяся с жестокостью со стороны родителей, либо гиперопека, что тоже является крайне неблагоприятной ситуацией воспитания в раннем детстве. Безнадзорность приводит к психической неустойчивости, импульсивности, взрывчатости и, конечно, безынициативности, к отставанию в интеллектуальном развитии. Гиперопека ведет к формированию искаженной, ослабленной личности, у таких детей обычно проявляется эгоцентризм, отсутствие самостоятельности в деятельности, недостаточная целенаправленность, неспособность к волевому усилию, эгоизм.

ЗПР церебрально-органического происхождения. Причиной нарушения темпа развития интеллекта и личности становятся грубые и стойкие локальные разрушения созревания мозговых структур (созревание коры головного мозга), токсикоз беременной, перенесенные вирусные заболевания во время беременности, грипп, гепатит, краснуха, алкоголизм, наркомания матери, недоношенность, инфекция, кислородное голодание. У детей этой группы отмечается явление церебральной астении, которое приводит к повышенной утомляемости, непереносимости дискомфорта, снижение работоспособности, слабая концентрация внимания, снижение памяти и, следствие этого, познавательная деятельность значительно снижена. Мыслительные операции не совершенны и по показателям продуктивности приближены к детям с олигофренией. Такие дети знания усваивают фрагментарно. Стойкое отставание в развитии интеллектуальной деятельности сочетаются у этой группы с незрелостью эмоционально-волевой сферы. Им необходима систематическая комплексная помощь медика, психолога, дефектолога.

29.05.2017, 25120 просмотров.

Задержка речевого развития – причины, симптомы, лечение и диагностика

По статистике детей в мире с задержкой психомоторного развития становится больше с каждым годом. Ребёнок с ЗПР нуждается в срочной медицинской и педагогической помощи. Своевременно обращение к врачу может помочь малышу ликвидировать отклонения в развитии, которые при ЗПР затрагивают не только речевую функцию, но и интеллектуальную, а также физическую. Таким детям сложно жить в социуме и находить общий язык со сверстниками и даже родственниками. Чаще всего задержка в психомоторном развитии встречается у мальчиков, а процент от всех аномалий составляет 8-10%.

Причины возникновения

Причины возникновения ЗПР могут быть самыми разными и порой врачам сложно определить корень проблемы. Но зачастую главными являются следующие факторы: наследственность, генетический переход заболевания; окружающая среда; травмы во время родов или уже в послеродовой период. В большинстве случаев, ЗПР передаётся по наследству, но не во всех случаях. Из-за разновидности и глубины синдрома, его принято классифицировать на две группы:

Первичная – образуется из нарушений в головном мозге, болезнь зарождается органически – самостоятельно;
Вторичная – ЗПР является следствием иного нарушения, считается частью структурных нарушений и аномалий головного мозга. Например, порог сердца или церебральный паралич протекает в совокупности с задержкой развития психомоторики.

Первичная патология возникает в следствие следующих факторов:

Болезнь матери в период беременности;
Кислородное голодание малышка в утробе матери;
Сложные проблемные роды;
Травма, полученная мамой во время родительной деятельности.

Вторичная патология появляется в следствие следующих факторов:

Врождённые повреждения и нарушения ЦНС;
Проблемы с психикой ребёнка;
ДЦП;
Гидроцефалия;
Прогрессирующий склероз головного мозга.

Исходя из причины возникновения ЗПР у ребёнка, сам синдром классифицируют на:

Конституциональный;
Соматогенный;
Психогенный;
Церебрально-органический.

Основной причиной возникновения заболевания является обстановка, окружающая малыша. Статистически, большинство детей, поступающих в больницы с подозрением на ЗПР, живут в асоциальных маргинальных семьях, где над ними издеваются, не ухаживают и не заботятся. Парадоксально, но в семьях с повышенной опекой, количество детей с ЗПР ненамного меньше.

Симптомы и диагностика

Задержка в психомоторном развитии относится докторами и международным институтом к нарушениям психологического здоровья. Дети, у которых ЗПР является врождённым, а не полученным, часто проявляют сигналы о синдроме довольно в раннем возрасте, хотя они могут отличаться в зависимости от периода. Симптомы по периодам выглядят следующим образом:

4 месяца – ребёнок не реагирует на родительские слова и обращения, проявляется слабая эмоциональность во всех отношениях;
8-9 месяцев – малыш даже не старается проговаривать какие-либо слова, не старается говорить все слова подряд, прибегая к так называемому «детскому лепету»;
1 год – ребёнок мало двигается, молчит, не плачет. Окружающие и даже зачастую родители принимают это за скромность и замкнутость характера;
1,5 года – малыш говорит несвязно, не старается употреблять новые слова или разговаривать, не откликается на своё имя. Врачи отмечают, что у детей с ЗПР в этом возрасте отсутствует понятие «желания», то есть они редко могут попросить о чём-то;
2 года – речь скудная, несвязная, у ребёнка нет интереса говорить новые слова или расти в «ментальном» смысле;
2,5 года – речь несвязная, малыш знает не более 20 слов и не пытается учить новые. Зачастую используемые 20 слов не превращаются в логически построенные предложения;
3 года – общение с кем-либо ограничено, ребёнок не мотивирован общаться. Малыш повторяет фразы, но не понимает их значения.

Помимо очевидных речевых и физических отклонений, ребёнок отстаёт в психическое и социальное созревание – быстро утомляется, отсутствует эмоциональная волевая функция, плохо работает логическое мышление, фантазия или воображение. Например, такие дети редко могут подолгу сидеть за одной игрой – они устают от неё. К тому же им присуще желание быстрого наслаждения, но они не готовы бороться за получение удовольствия, то есть играть в развивающие игры или собирать пазл.

Для детей с ЗПР характерно стремление к получению удовольствия, поэтому они быстро бросают занятия, требующие сосредоточенности и напряжения, игровая деятельность носит, как правило, примитивный характер. Нарушение психического и речевого развития могут сочетаться с отставанием в физическом созревании, иногда ЗПР соседствует с ДЦП. Врач, осматривающий такого ребёнка, проводит специальный тест – дифференциальную диагностику, способную понять, есть у ребёнка ЗПР или нет. В этом помогают и другие исследования:

МРТ, КТ;
ЭЭГ;
Исследования ВП.

С детьми проводят различные игры, проводят тесты, разговаривают, чтобы понять на какой стадии находится развитие синдрома, как малыш адаптируется к социуму и диалогу. После этого принимается решение о лечение, составляется индивидуальный план под каждого ребёнка, ведь любой случай – уникальный.

Лечение ЗПР

Дети с задержкой психомоторного развития нуждаются в разной медицинской помощи, им помогают врачи различного спектра: невропатологи, психологи, логопеды, педагоги. Лечение представляет собой полную структуру с планом и обилием специалистов. Оно также делится на составляющие. Лечение бывает:

Медикаментозным. Оно задействует препараты, травы, таблетки, лекарства, выписанные и назначенные невропатологом;
Физиотерапия – физические упражнения, массажи, водолечение;
Транскраниальная магнитная стимуляция – воздействие импульсами тока на определенные нервные центры мозга через черепную коробку.

Над лечением ребёнка работают врачи разного спектра. Психолог и логопед помогает ребёнку осваивается в социуме, общается с ним, учит разговаривать и мыслить. В этом помогают современные психологические метод: рисование, игры, сказки и так далее. Физиотерапевты развивают физическую составляющую и помогают ребёнку оставаться в тонусе и не отставать от сверстников физически. Педагоги работают над общим образованием ребёнка. Часто детей отводят в специальные группы дошкольного возраста, где им становится легче адаптироваться к обществу.

Механизм воздействия на ЦНС ребенка многогранный и требует терпения, регулярной работы, сотрудничества врачей, педагогов и родителей. Поэтому рекомендуется помещать детей с синдромом психомоторной задержки в специальные группы дошкольных и младших школьных учреждений. Эти группы имеются в профильных учреждениях VII вида, в которых детям помогают адаптироваться в социальной среде, научиться общению с одногодками и взрослыми окружающими, не зависеть от помощи взрослых в элементарных бытовых действиях.

По статистике, дети с ЗПР побеждают отклонения и аномалии в ЦНС при должном лечение и своевременном обращение к доктору. Раннее обнаружение заболевания, комплексное лечение, структурный план развития помогает большинству детей победить болезнь ещё в раннем возрасте, практически в самом начале её образования.

Профилактика

Безусловно, задержка в психомоторном развитии часто остаётся побеждённой и в целом у врачей обычно хорошие прогнозы по поводу будущего ребёнка с ЗПР. Но даже современные методы лечения не могут предотвратить заболевание, поэтому по заверениям профильных врачей, с каждым годом эта аномалия всё чаще и чаще будет встречаться у детей. Количество больных будут продолжать поступать в больницы, если люди не будут следовать правилам профилактики:

Планирование беременности должно начинаться с медицинского обследования на генетические и хронические заболевания;
Женщина должна регулярно находиться у специалиста под присмотром в период гестации;
Следить за ребёнком, проверять его физическое и эмоциональное состояние, заботиться о нём.

Родители обязаны быть в курсе возрастных особенностей своего малыша, знать нормы, принципы, признаки проявлений различных аномалий и при обнаружение малейших подозрений, срочно обращаться к врачу.

Задержка психического развития (ЗПР)

Задержка психического развития (ЗПР) – это нарушение нормального темпа психического развития, когда отдельные психические функции ребенка (память, внимание, мышление, эмоционально-волевая сфера) отстают в своём развитии от принятых психологических норм для данного возраста. ЗПР, как психолого-педагогический диагноз ставится только в дошкольном и младшем школьном возрасте, если к окончанию этого периода остаются признаки недоразвития психических функций, то речь идёт уже о конституциональном инфантилизме или об умственной отсталости.

Дети, которым ставят диагноз ЗПР (задержка психического развития) рождаются, как правило, у здоровых родителей, а задержка развития – следствие биологических или социальных причин, имевших место до рождения ребенка или в процессе его взросления, а именно:

Причины возникновения ЗПР

К биологическим причинам возникнования ЗПР относят:

патологию беременности (тяжелые токсикозы, инфекции, интоксикации и травмы), внутриутробная гипоксия плода;
недоношенность;
асфиксия и травмы при родах;
заболевания инфекционного, токсического и травматического характера на ранних этапах развития ребёнка;
генетическая обусловленность.

К социальным причинам возникновения ЗПР относят:

длительное ограничение жизнедеятельности ребёнка;
неблагоприятные условия воспитания, частые психотравмирующие ситуации в жизни ребёнка.

При ЗПР первичный интеллект ребенка не снижается, но в силу своей истощенности, оказывается крайне нетрудоспособным в процессе дошкольных и школьных занятий. У всех детей с данной формой ЗПР имеют место выраженные астенические симптомы в виде головной боли, повышенной утомляемости, снижение работоспособности, на этом фоне возникает эмоциональное расстройство, переживание, внимание снижается, память и интеллектуальное напряжение удерживается на очень короткое время.

Эмоционально-волевая сфера у детей с ЗПР отличается незрелостью при относительно сохраненном интеллекте. В состоянии работоспособности дети с ЗПР могут усваивать учебный материал, а в период упадка работоспособности они могут отказаться от работы. Такие детки склонны фиксировать внимание на своем самочувствии и могут воспользоваться этими способностями для того, чтобы избежать трудностей.

Ребенок с диагнозом ЗПР испытывает трудности в адаптации к новой среде. Дети с соматогенной ЗПР нуждаются в систематической психолого-педагогической помощи.

Особенности воспитания и обучения детей с задержкой в развитии

В массовой школе учится значительное число детей, которые уже в начальных классах не справляются с программой обучения и имеют трудности в общении. Особенно остро названная проблема стоит перед детьми с задержкой психического развития. Проблема трудностей обучения этих детей выступает как одна из наиболее актуальных психолого-педагогических проблем.

Поступающим в школу детям с задержкой психического развития присущ ряд специфических особенностей. В целом у них не сформированы нужные для усвоения программного материала умения, навыки и знания, которыми нормально развивающиеся дети обычно овладевают в дошкольный период. В связи с этим дети оказываются не в состоянии (без специальной помощи) овладеть счетом, чтением и письмом.

Причины возникновения задержки психического развития

К.С. Лебединской в 1980 г. был предложен свой вариант классификации ЗПР. В основу данной классификации легла этиопатогенетическая систематика. Выделяют 4 основных типа ЗПР:

♦ конституционального характера;

♦ соматогенного характера;

♦ психогенного характера;

♦ церебрально-органического характера.

Все 4 типа имеют свои особенности. Отличительная черта данных типов состоит в их эмоциональной незрелости и нарушении познавательной деятельности. Кроме того, нередко могут возникать осложнения в соматической и неврологической сферах, но основное отличие — в особенности и характере соотношений двух важных составляющих этой аномалии развития: структуры инфантилизма и особенностей развития всех психических функций.

ЗПР конституционального происхождения

ЗПР соматогенного происхождения

ЗПР психогенного характера

ЗПР церебрально-органического происхождения

Психофизическая характеристика детей с ЗПР

В данное время внимание многих специалистов из областей педагогики, психологии и медицины привлекают дети с не сильно выраженными основами интеллектуальной недостаточности, которая наиболее заметно начинает бросаться в глаза, когда дети поступают в общеобразовательные школы.

При обследовании таких детей выяснилось, что основной причиной их неуспеваемости и отклонений в поведении являются небольшие органические поражения в головном мозге. В связи с этим, такие психические функции, как речь, мышление, восприятие, эмоции, память и т.п. формируются не только позже, но и несколько иначе.

Психофизическая характеристика детей с ЗПР

Если сравнить детей нормально развивающихся с этой категорией детей, то у вторых отмечается низкий уровень восприятия (данные Б.И. Белого, П.Б. Шошина). Представление об окружающем мире они способны получить только на основе понимания и ощущения свойств предметов. Дети с ЗПР значительно менее способны принять и переработать поступающую к ним через органы чувств информацию. К особенностям восприятия относится и неспособность ребенка найти необходимую вещь, если он заведомо не знает, где она находится. Такие дети страдают недостатком пространственного восприятия и недостатками в мыслительной деятельности. Для детей с ЗПР представляет трудность целостное восприятие. Детям этой категории с большим трудом удается или вообще не удается вычленить отдельную часть из общего объекта, дорисовать, достроить объект.

Исследования Шошина П.Б. показали, что на быстроту восприятия этой категории детей влияет любое отклонение от их привычных условий жизни. Например, им трудно быстро определить предмет и его свойства, если этот предмет стоит не так, как они привыкли, такое же действие может оказать плохая освещенность либо одновременная подача нескольких сигналов. Некоторые исследователи отмечают трудности детей с задержкой психического развития в ориентации влево и вправо, а также то, что у этой категории детей целенаправленность и поэтапность в обследовании предмета отсутствуют, их действия при этом импульсивны и непоследовательны (Л. В. Кузнецова).

У детей с задержкой психического развития страдает процесс сложно-логического мышления. Наглядно-действенное мышление у них протекает почти наравне с нормально развивающимися детьми. Наглядно-образное мышление доступно не всем детям, в этой категории есть дети, которые лучше справляются с заданием, а есть те, которые не могут в полном объеме его выполнить.

К первому классу дети с ЗПР испытывают трудности в сформированности словесно-логического уровня. Дети не понимают, что в задании главное, что второстепенное. В этом контексте понимания главное для них — речевое наглядно-образное мышление, а не конкретно-понятийное. Эта категория детей отличается еще и инертностью мышления.

По данным некоторых исследователей, у детей с задержкой психического развития особенно выражена низкая речевая активность, несформированность речи и, как следствие, ее отставание. Словарный запас этой категории детей ограничен. У детей недостаточно сформирована сторона фонематического слуха: им трудно различить фонемы. Для этой категории детей характерны также затруднения в логико-грамматическом составе речи. По данным некоторых исследователей, при письме отмечается парография (пропуски букв, их перестановки и замены), имеются трудности в ориентации на листе, иногда встречается зеркальность в написании.

Дети этого вида дефицитарного развития характеризуются эмоциональной нестойкостью, эффективностью (возбудимостью) поведения, неустойчивостью волевых установок, вялостью, апатичностью либо, наоборот, двигательной неограниченностью. Отсутствие самостоятельности, наивности, внушаемости у таких детей сочетается с эмоционально-волевой незрелостью.

От обычных детей ребенка с ЗПР можно отличить по некоторым особенностям.

1. Дети с такими отклонениями в психическом развитии очень быстро утомляются, не могут усваивать данный объем работы, у них занижен уровень работоспособности.

2. Детям с ЗПР трудно принимать и обрабатывать (анализировать) информацию, которая идет от учителя. Для более полного восприятия ему необходимо опираться на наглядные пособия. Трудности возникают и при мыслительной деятельности, т.к. словесно-логическое мышление неразвито.

3. Дети этой категории испытывают трудности с общепринятыми в школе формами поведения. Они часто задираются, дерутся со сверстниками, не воспринимают школьные правила. Детям с ЗПР сюжетно-ролевые игры недоступны, но ради того, чтобы уйти от трудных заданий, они могут с удовольствием поиграть в более простые игры.

4. Детям с ЗПР трудно организовывать свою деятельность.

5.Обучение по программе общеобразовательной школы для них неприемлемо, т.к. их психическое развитие находится на более раннем уровне. Поэтому учителю необходимо понаблюдать за такими детьми, для правильной дифференциации, быть очень терпеливым. У детей с ЗПР психическое недоразвитие ярко выражено в снижении обучаемости. Но если таким детям оказать вовремя специальную коррекционно-педагогическую помощь, они в состоянии будут догнать своих нормально развивающихся сверстников.

У таких детей иногда эмоциональные вспышки носят характер ярко выраженных двигательных и вегетативных реакций. Такого ребенка трудно привести в норму. Это состояние довольно стойкое, причем, у некоторых детей после конфликта сохраняется желание мстить (исследования К.С. Лебединской и др.).

У некоторых детей встречается, напротив, эйфорический фон настроения. Они дурашливы, смешливы, двигательно активны (исследования К.С. Лебединской и др.).

При психопатоподобных состояниях встречаются негативистические проявления, выраженные в повышенной сексуальности, склонности к воровству, бродяжничеству и т.п.

По данным ряда зарубежных исследователей, к главным особенностям личности детей этой группы дефицитарного развития относятся нестойкие эмоциональные процессы, трудности освоения в новом коллективе, частые смены настроения. Детям с недоразвитием эмоционально-волевой сферы неинтересны предлагаемые задания или какая-либо работа, у них отмечается слабость механизмов побуждения к деятельности, нечеткость проделываемой работы, нет четкого плана действий. В связи с этим наблюдается низкий уровень интеллектуальной деятельности.

Методические рекомендации при подготовке к проведению уроков по математике с детьми с задержкой психического развития.

1. При проведении любого коррекционно – развивающего занятия по математике необходимо учитывать психофизические особенности детей с ЗПР.

2. Необходимо уделять особое внимание и значение пропедевтическому периоду.

3. Программные задачи выполнять последовательно, используя принцип дидактики: от простого — к сложному.

4. Замедленный темп усвоения нового материала детьми данной категории предполагает проведение по одной и той же теме двух и более занятий.

5. На первых этапах обучения рекомендуется использовать простые, одноступенчатые инструкции, задания выполнять поэтапно.

6. Обучать детей речевому отчету о проделанных действиях.

7. Переходить к следующей теме только после того, как будет усвоен предыдущий материал.

8. При проведении тематических занятиях (например, по сказке) необходим творческий подход педагога к сценарию занятия, т.е. педагог должен понимать, по какой сказке и сколько занятий можно планировать по одному и тому же сюжету.

9. Использовать как традиционные методы обучения (наглядные, словесные, практические, игровые), так и нетрадиционные, новационные подходы.

10. Грамотно использовать наглядность.

11. Задействовать возможно большее количество различных анализаторов при выполнении счетных операций.

12. Каждое занятие должно выполнять коррекционные задачи.

13.Желательно на каждом занятии наиболее активно использовать дидактические игры и упражнения.

14. Использовать индивидуальный и дифференцированный подход к детям.

15. Доброжелательно и уважительно относиться к каждому ребенку.

Методические рекомендации по проведению физкультурных минуток в работе с детьми с задержкой психического развития.

1. Необходимо учитывать возраст и психофизическое развитие детей с задержкой психического развития.

2. Желательно, чтобы упражнения были связаны с темой занятия, т.к. у детей с ЗПР переключение с одной деятельности на другую происходит труднее, чем у нормально развивающихся детей.

3. Упражнения, используемые на фронтальном коррекционно – развивающем занятии, должны быть просты по структуре, интересны и хорошо знакомы детям.

4. Упражнения должны быть удобны для выполнения на ограниченной площади.

5. Рекомендуется подбирать такие упражнения, в которые включаются движения, воздействующие на крупные группы мышц, улучшающие функциональную деятельность всех органов и систем.

6. Упражнения, используемые в физкультурной минутке, должны быть эмоциональными, достаточно интенсивными (с включением 10–15 подскоков, 10 приседаний или 30 – 40 секунд бега на месте).

7. Общая длительность физкультурной минутки составляет 1,5 – 2 минуты.

8. Учителю, работающему с детьми с ЗПР, рекомендуется проводить физкультурную минутку на 5 минут раньше, т.к. у детей данной категории утомление наступает раньше.

9. При необходимости возможно проведение двух физкультурных минуток на одном фронтальном коррекционно – развивающем занятии.

10. Упражнения повторяются 5 — 6 раз.

11. Физкультурная минутка должна выполнять смысловую нагрузку: на занятии по математике – с элементами счета, на обучении грамоте – насыщена изучаемым звуком и т.д.

На странице курсовые работы по педагогике вы найдете много готовых тем для курсовых по предмету «Педагогика».

Читайте дополнительные лекции:

Общение в педагогическом коллективе
Совершенствование интонационных умений младших школьников
Коммуникативная компетенция вожатого детского лагеря
Методологические основы педагогики
Методика диагностики дислексии детей
Новые технологии воспитания детей раннего возраста
Анализ научных публикаций по проблеме индивидуализации образовательного процесса
Воспитательный процесс
Литература во второй младшей группе, картотека
Вклад е. И. Тихеевой в создание отечественной методики развития речи дошкольников

понятие, причины возникновения, структура дефекта

Нужна помощь в написании работы?

Задержанное развитие – замедление темпа развития психики. Полиформная группа, представленная разнообразными вариантами инфантилизма. Выражается в недостаточности общего запаса знаний, ограниченности представлений, незрелости мышления, преобладании игровых интересов, быстрой пресыщаемости в интеллектуальной деятельности, эмоциональной незрелости. Типичной моделью задержанного развития является задержка психического развития (ЗПР). В отличие от умственной отсталости характеризуется парциальным замедлением развития и разными степенями обратимости.

Понятие «задержка психического развития».

Задержка психического развития (ЗПР) – нарушение темпа всего психического развития при наличии значительных потенциальных возможностей развития ребенка при специальном его обучении (А.О. Дробинская).

Особенностью ЗПР является качественно иная структура интеллектуальной недостаточности по сравнению с умственной отсталостью. Если при последней первично страдает интеллект, то при ЗПР – его предпосылки (память, внимание, пространственная ориентация и т.д.). У детей с ЗПР отсутствует инертность психических процессов, они способны не только принимать и использовать помощь, но и переносить усвоенные навыки умственной деятельности в другие ситуации. С помощью взрослого они могут выполнять предлагаемые им интеллектуальные задания на близком к норме уровне. У детей с ЗПР достаточно высокие потенциальные возможности обратимости отставания от сверстников, в связи с тем, что у них парциальное (мозаичное) поражение коры головного мозга, а при умственной отсталости — тотальное (диффузное).

Поможем написать любую работу на аналогичную тему

Получить выполненную работу или консультацию специалиста по вашему учебному проекту

Узнать стоимость Поделись с друзьями

Сверхэкспрессия белков ZPR вызывает абаксиализацию листьев …

Контекст 1

… проверить эту гипотезу, мы сверхэкспрессировали ZPR3 и ZPR1 в Arabidopsis с вирусного промотора CaMV35S. Трансгенные растения, сверхэкспрессирующие ZPR3, действительно демонстрировали фенотип абаксиальных листьев (фиг. 5). У сильно пораженных растений меристема оканчивалась абаксиальными стержневидными листьями (рис. 5А). …

Контекст 2

… растения, сверхэкспрессирующие ZPR3, действительно демонстрировали фенотип абаксиализированных листьев (фиг. 5).У сильно пораженных растений меристема оканчивалась абаксиальными стержневидными листьями (рис. 5А). Мы также наблюдали абаксиальные, трубчатые листья и листья, закрученные вниз (Рисунки 5B и 5C). …

Контекст 3

… скрученные листья также наблюдаются, когда активность гена HD-ZIPIII снижается за счет повышения уровня микроРНК 166 (Williams et al., 2005b) и противоположно скручиванию вверх, когда HD- Активность ZIPIII повышена (Mallory et al., 2004; Ochando et al., 2006). Листья растений 35S: ZPR3 имеют сосудистую сеть, типичную для абаксиализированных растений, с флоэмой, почти окружающей ксилему (Рисунки 5K и 5L). У трансгенных растений, сверхэкспрессирующих ZPR1, также образовывались завитые вниз листья (рис. 5D), но этот фенотип был менее проницаемым, чем у растений, сверхэкспрессирующих ZPR3 (загнутые вниз листья наблюдались у 2/12 растений 35S: ZPR1 T1 по сравнению с 6/13 растений T1 35S: ZPR3. ). …

Контекст 4

… из 35S: растения ZPR3 имеют сосудистую сеть, типичную для абаксиализированных растений, с флоэмой, почти окружающей ксилему (рисунки 5K и 5L).У трансгенных растений, сверхэкспрессирующих ZPR1, также образовывались завитые вниз листья (рис. 5D), но этот фенотип был менее проницаемым, чем у растений, сверхэкспрессирующих ZPR3 (загнутые вниз листья наблюдались у 2/12 растений 35S: ZPR1 T1 по сравнению с 6/13 растений T1 35S: ZPR3. ). У трансгенных растений 35S: ZPR1 не наблюдали трубчатых листьев (наблюдали у растений 0/12 35S: ZPR1 T1 по сравнению с 4/13 растениями 35S: ZPR3 T1). …

Контекст 5

… фенотипические сходства между мутантами, сверхэкспрессирующими ZPR3 и лишенными активности HD-ZIPIII, видны в пластинке листа.35S: растения ZPR3 образуют листья с шероховатой текстурой пластинок и гребнями вдоль средней жилки и пластинки (рис. 5F). Шероховатый лист с гребнями средней жилки был замечен у мутантов с пониженной активностью трех из пяти генов HD-ZIPIII (например, (B) Выравнивание лейциновых застежек из Arabidopsis REV (класс III HD-ZIP), ZPR1 (At2g45450), Белки ZPR2 (At3g60890), ZPR3 (At3g52770), ZPR4 (At2g36307), HD-ZIP1 (белок HD-ZIP класса I), HD-ZIP2 (HD-ZIP класса II) и GL2 (HD-ZIP класса IV). ..

Контекст 6

… phb / þ; rev мутанты; Prigge et al., 2005). 35S: растения ZPR3 с грубыми лопастями показали повышенную плотность жилок (рис. 5H). Кроме того, вены были окружены гребнями из мелких клеток, что указывало на эктопическую пролиферацию клеток (рис. 5J). …

Контекст 7

… растения с грубыми лопастями показали повышенную плотность жилок (рис. 5H). Кроме того, вены были окружены гребнями из мелких клеток, что указывало на эктопическую пролиферацию клеток (рис. 5J).Эти гребни были видны на адаксиальной, но не абаксиальной поверхности. …

Контекст 8

… эмбрион и не отражает экспрессию GUS). Мы также исследовали экспрессию трансгена GUS в вегетативно растущих растениях (Рисунки 2H и 2I). Подобно нашим находкам в семядолях, экспрессия наблюдалась в основном в адаксиальном эпидермисе листьев. Экспрессия в субэпидермальных слоях происходила в области над средней веной. В черешке экспрессия была более обширной в адаксиальном домене.Когда аминокислотная последовательность ZPR1 использовалась в качестве запроса в поиске psi- BLAST (Altschul et al., 1997), было обнаружено, что она содержит домен лейциновой молнии, похожий на домен лейциновой молнии, обнаруженный в белках HD-ZIPIII, но не похожий на домен лейциновой молнии, обнаруженный в белках HD-ZIP класса I, II или IV (рисунки 3A и 3B). Белки ZPR различаются по расположению лейциновой молнии внутри белка: лейциновая молния является центральной в ZPR1 и ZPR2 и N-концевой в ZPR3 и ZPR4 (рис. 3A). Белки ZPR широко консервативны у покрытосеменных растений с пятью гомологами, обнаруженными в рисе (Oryza sativa; см. Дополнительный рисунок 1 онлайн; рисунок 3D).Изучение филогенетического дерева показывает, что различие между типами ZPR1 / ZPR2 и типами ZPR3 / ZPR4 белков ZPR предшествует разделению однодольных (например, рис) и двудольных (например, арабидопсис) растений. Лейциновые молнии представляют собой спиральные домены, состоящие из гептадных повторов с остатком Leu в положении «d» (Landschulz et al., 1988). Каждая гептада представляет собой два витка спирали. У растений родственные аминокислоты Ile и Met часто встречаются вместо остатка Leu в положении «d» (Deppmann et al., 2004). Аминокислоты в положениях «а» и «d» находятся на межспиральном интерфейсе (рис. 3С). Положение «а» занимает Asn во второй, третьей, четвертой и шестой гептадах в лейциновых застежках белков ZPR и HD-ZIPIII. Asn в положении «а» благоприятно взаимодействует с Asn и неблагоприятно с алифатическими аминокислотами в положении «а» в спирали партнера (Acharya et al., 2002). Основываясь на аналогичной структуре остатков Asn в положениях «а» как в лейциновых застежках ZPR, так и в HD-ZIPIII, белки ZPR и HD-ZIPIII могут образовывать параллельные гетеродимеры друг с другом (рис. 3C).В отличие от многих белков гомеодомена животных, которые связывают ДНК как мономеры, белки HD-ZIP связывают ДНК как димеры (Sessa et al., 1993). Фактически, аминокислотные остатки в петле между первой и второй спиралями гомеодомена в белках HD-ZIP предотвращают связывание гомеодомена с ДНК в качестве мономера (Tron et al., 2004). Следовательно, предполагается, что гетеродимеризация белков ZPR, у которых отсутствует гомеодомен, с белками HD-ZIPIII либо изменяет, либо отменяет связывание с ДНК белков HD-ZIPIII. Этот прогноз наиболее ясен для типа ZPR3 / ZPR4 белка ZPR, у которого отсутствует N-конец удлинения к лейциновой молнии, и менее ясен для типа ZPR1 / ZPR2, который несет N-конец удлинения к лейциновой молнии и потенциально может контактировать с основа ДНК.Структурные особенности белков ZPR и их индукция с помощью активности HD-ZIPIII предполагают модель действия генов ZPR как части петли отрицательной обратной связи на функцию HD-ZIPIII (рис. 3E). В предлагаемом регуляторном модуле белки HD-ZIPIII активируют транскрипцию генов ZPR. Затем белки ZPR образуют гетеродимеры с белками HD-ZIPIII, предотвращая или изменяя их связывание с ДНК. Для проверки предложенной выше модели мы исследовали способность белка REV HD-ZIPIII взаимодействовать с белками ZPR in vitro.Белки ZPR, слитые с эпитопом домена активации GAL4 (GAD), и немаркированные белки REV были синтезированы в бесклеточной системе в присутствии 35 S-Met (рисунок 4A; см. Дополнительный рисунок 2 онлайн). Иммунопреципитация любого из четырех белков GAD-ZPR с использованием антитела против GAD из смеси с REV осаждала белок REV (рис. 4A). Иммунопреципитация белка GAD из смеси с REV не приводила к преципитации белка REV. Мы пришли к выводу, что белки REV и ZPR обладают способностью физически взаимодействовать in vitro.Этот эксперимент был повторен более трех раз с аналогичными результатами. В качестве дальнейшего тестирования модели мы спросили, может ли ZPR3 предотвратить связывание ДНК с помощью REV (рис. 4B). Белок REV в присутствии белка GAD, связанного с радиоактивно меченным олигонуклеотидом, несущим один сайт связывания HD-ZIPIII, заставляя этот олигонуклеотид медленнее мигрировать в акриламидном геле. Белок REV не связывался с аналогичным олигонуклеотидом, в котором последовательность была зашифрована. В присутствии ZPR3 способность REV связывать ДНК была отменена.Если белки ZPR образуют гетеродимеры с белками HD-ZIPIII и предотвращают связывание ДНК in vivo, мы ожидаем, что это взаимодействие приведет к ингибированию функции HD-ZIPIII. Чтобы проверить эту гипотезу, мы сверхэкспрессировали ZPR3 и ZPR1 в Arabidopsis с вирусного промотора CaMV35S. Трансгенные растения, сверхэкспрессирующие ZPR3, действительно демонстрировали фенотип абаксиальных листьев (фиг. 5). У сильно пораженных растений меристема оканчивалась абаксиализированными палочковидными листьями (рис. 5А). Мы также наблюдали абаксиальные, трубчатые листья и листья, закрученные вниз (Рисунки 5B и 5C).Закрученные вниз листья также наблюдаются, когда активность гена HD-ZIPIII снижается за счет увеличения уровня микроРНК 166 (Williams et al., 2005b), и противоположно скручиванию вверх, когда активность HD-ZIPIII увеличивается (Mallory et al., 2004; Ochando). и др., 2006). Листья растений 35S: ZPR3 имеют сосудистую сеть, типичную для абаксиализированных растений, с флоэмой, почти окружающей ксилему (рисунки 5K и 5L). У трансгенных растений со сверхэкспрессией ZPR1 также образовывались скрученные вниз листья (рис. 5D), но этот фенотип был менее проницаемым, чем у растений со сверхэкспрессией ZPR3 (скрученные вниз листья наблюдались у 2/12 растений 35S: ZPR1 T1 по сравнению с 6/13 растений T1 35S: ZPR3. ).У трансгенных растений 35S: ZPR1 не наблюдали трубчатых листьев (наблюдали у растений 0/12 35S: ZPR1 T1 по сравнению с 4/13 растениями 35S: ZPR3 T1). Важно отметить, что мы не видели голых растений ни в трансформантах 35S: ZPR1, ни в 35S: ZPR3. Если бы белки ZPR могли связываться и ингибировать белок HD-ZIP GL2 класса IV, это должно было привести к появлению безволосых растений. Дополнительные фенотипические сходства между мутантами, сверхэкспрессирующими ZPR3 и лишенными активности HD-ZIPIII, наблюдаются в пластинке листа. 35S: растения ZPR3 образуют листья с шероховатой текстурой пластинок и гребнями вдоль средней жилки и пластинки (рис. 5F).Шероховатый лист с гребнями средней жилки был замечен у мутантов с пониженной активностью трех из пяти генов HD-ZIPIII …

Происхождение нового регуляторного модуля в результате дупликации и дегенерации фактора транскрипции древнего растения

https: // doi .org / 10.1016 / j.ympev.2014.06.017Получить права и контент

Основные моменты

•: МАЛЕНЬКИЕ ЗИПЫ (ZPR) регулируют функцию HD-Zip класса III (C3HDZ) в Arabidopsis .
•: Мы показываем, что гены ZPR также присутствуют у голосеменных и монилофитов.
•: Нецветущие ZPR имеют большее сходство последовательностей с C3HDZ, чем ZPR покрытосеменных.
•: Гены ZPR филогенетически связаны с генами C3HDZ и происходят от них.
•: ZPRS — это новый регуляторный модуль, полученный в результате дупликации древнего гена.

Реферат

Принято считать, что дупликации генов являются сырьем для морфологической эволюции.Как количество генов, так и размер семейств генов увеличились в ходе диверсификации наземных растений. Несколько небольших белков, которые регулируют факторы транскрипции, недавно были идентифицированы у растений, в том числе белки LITTLE ZIPPER (ZPR). ZPR являются посттрансляционными негативными регуляторами, посредством гетеродимеризации, белков гомеодомена лейциновой молнии (C3HDZ) класса III, которые играют ключевую роль в управлении формой и ростом растений. Мы показываем, что гены ZPR возникли как дупликация паралога фактора транскрипции C3HDZ у общего предка эуфиллофитов (папоротники и семенные растения).ZPR развивались в результате дегенеративных мутаций, приводящих к потере всех функциональных доменов C3HDZ, за исключением лейциновой молнии, которая модулирует димеризацию. ZPR представляют собой новый регуляторный модуль сети C3HDZ, уникальный для линии эуфиллофитов, и их происхождение коррелирует с периодом быстрых морфологических изменений и повышенной сложности наземных растений. Происхождение ZPR иллюстрирует важность дупликаций генов в создании сложности развития во время эволюции наземных растений, что, вероятно, привело к морфологической эволюции.

Сокращения

C3HDZ

Гомеодоменная лейциновая молния класса III

SRP

малый регуляторный белок

Ключевые слова

Эволюция семейства генов

Дупликация гена

Гомеодоменная лейциновая молния

LITTLE ZIPPER

статей Эволюция

Разработка

статей )

Ссылки на статьи

Белок выживания мотонейронов использует свой ZPR для ядерной локализации

Wirth, B. Hum. Мутат. 15 , 228–237 (2000).

CAS Статья Google ученый

Lefebvre, S. et al . Cell 80 , 155–165 (1995).

CAS Статья Google ученый

Лорсон, К. Л., Ханен, Э., Андрофи, Э. Дж. И Вирт, Б. Proc. Natl Acad. Sci. США 96 , 6307–6311 (1999).

CAS Статья Google ученый

Frugier, T. et al . Hum. Мол. Genet. 9 , 849–858 (2000).

CAS Статья Google ученый

Гангвани Л., Микрут М., Галчева-Гаргова З. и Дэвис Р. Дж. J Cell Biol 143 , 1471–1484 (1998).

CAS Статья Google ученый

Галчева-Гаргова, З. и др. . Наука 272 , 1797–1802 (1996).

CAS Статья Google ученый

Schlessinger, J. Cell 103 , 211–225 (2000).

CAS Статья Google ученый

Галчева-Гаргова З. и др. . Mol. Биол. Ячейка 9 , 2963–2971 (1998).

CAS Статья Google ученый

Gangwani, L., Mikrut, M., Theroux, S., Sharma, M. & Davis, R.J. Nature Cell Biol. 3 , 376–383 (2001).

CAS Статья Google ученый

Matera, A. G. Trends Cell Biol. 9 , 302–309 (1999).

CAS Статья Google ученый

Фишер У., Лю К. и Дрейфус Г. Cell 90 , 1023–1029 (1997).

CAS Статья Google ученый

Pellizzoni, L., Charroux, B., Rappsilber, J., Mann, M. & Dreyfuss, G. J. Cell. Биол. 152 , 75–86 (2001).

CAS Статья Google ученый

Friesen, W. J. & Dreyfuss, G. J. Biol. Chem. 275 , 26370–26375 (2000).

CAS Статья Google ученый

Шарру, Б. и др. . J. Cell Biol. 148 , 1177–1186 (2000).

CAS Статья Google ученый

Gall, J. G. Annu. Rev. Cell Dev. Биол. 16 , 273–300 (2000).

CAS Статья Google ученый

Francis, J. W., Sandrock, A. W., Bhide, P. G., Vonsattel, J. P. & Brown, R.H.J. Proc.Natl Acad. Sci. США 95 , 6492–6497 (1998).

CAS Статья Google ученый

Инфекция COVID-19 увеличивает риск преэклампсии, о чем сообщили исследователи WSU и PRB — School of Medicine News

Недавно опубликованное исследование показало, что женщины, заразившиеся COVID-19 во время беременности, подвергаются значительно более высокому риску развития преэклампсии, основной причины материнской и младенческой смертности во всем мире.

В статье «Инфекция SARS-COV-2 во время беременности и риск преэклампсии: систематический обзор и метаанализ», опубликованной в Американском журнале акушерства и гинекологии, исследователи заявили, что их систематический обзор показывает, что женщины с инфекцией SARS-CoV-2 во время беременности вероятность развития преэклампсии на 62% выше, чем у тех, у кого не было инфекции во время беременности.

«Эта связь была удивительно последовательной для всех предопределенных подгрупп. Более того, инфекция SARS-CoV-2 во время беременности была связана со значительным увеличением шансов преэклампсии с тяжелыми проявлениями, эклампсии и HELLP-синдрома », — сказал Роберто Ромеро, M.D., доктор медицинских наук, руководитель отделения перинатологических исследований и профессор молекулярного акушерства и генетики медицинского факультета государственного университета Уэйна.

Доктор Ромеро и Агустин Конде-Агудело, доктор медицины, магистр здравоохранения, доктор философии, адъюнкт-профессор акушерства и гинекологии, опубликовали свои результаты после обзора 28 предыдущих исследований, в которых участвовали 790 954 беременных женщины, в том числе 15 544 женщины с диагнозом COVID-19.

«Как бессимптомная, так и симптоматическая инфекция значительно увеличивают риск преэклампсии», — сказал д-р.- сказал Ромеро. «Тем не менее, вероятность развития преэклампсии была выше среди пациентов с симптоматическим заболеванием, чем среди пациентов с бессимптомным заболеванием».

Преэклампсия — это внезапное повышение артериального давления после 20-й недели беременности. Предупреждающие признаки преэклампсии, помимо повышенного артериального давления, могут включать головные боли, отек лица и рук, нечеткость зрения, боль в груди и одышку. Хотя состояние может проявиться в течение нескольких часов, некоторые женщины сообщают о незначительных симптомах или их отсутствии.

По оценкам Фонда преэклампсии, это заболевание является причиной 76 000 материнских смертей и более 500 000 младенческих смертей каждый год. Это может повлиять на печень, почки и мозг. У некоторых матерей развиваются судороги (эклампсия) и внутричерепное кровоизлияние, что является основной причиной смерти тех, у кого это заболевание развивается. У некоторых женщин развивается слепота. Дети матерей с преэклампсией страдают от этого заболевания, у них может развиться задержка внутриутробного развития или умереть в утробе матери.

Чем раньше начнется заболевание во время беременности, тем хуже для ребенка и матери. Женщины с преэклампсией часто не ощущают последствий, пока состояние не станет тяжелым и не станет опасным для жизни. Воздействие на мать включает проблемы с сердцем, возможное кровоизлияние в мозг, острую почечную недостаточность, проблемы со свертыванием крови и возможную слепоту. Если не выявить, состояние может прогрессировать до эклампсии, и у матери могут начаться судороги. Для плода преэклампсия связана с уменьшением плацентарного кровотока, что приводит к физическим и умственным недостаткам, замедлению внутриутробного развития, а в тяжелых случаях младенцы могут родиться мертвыми.

HELLP-синдром — это форма тяжелой преэклампсии, которая включает гемолиз (разрыв красных кровяных телец), повышение ферментов печени и низкое количество тромбоцитов.

Хотя необходимы дальнейшие исследования для определения физических механизмов между инфекцией COVID-19 и преэклампсией, авторы говорят, что медицинские работники должны знать об этой связи и внимательно следить за беременными женщинами, которые инфицированы, для раннего выявления преэклампсии.

% PDF-1.6 % 95 0 объект > эндобдж xref 95 102 0000000016 00000 н. 0000003578 00000 н. 0000003791 00000 н. 0000004060 00000 н. 0000004103 00000 п. 0000004246 00000 п. 0000004353 00000 п. 0000005000 00000 н. 0000005767 00000 н. 0000006241 00000 н. 0000006294 00000 н. 0000008077 00000 н. 0000008131 00000 п. 0000009898 00000 н. 0000011553 00000 п. 0000012378 00000 п. 0000012779 00000 п. 0000012816 00000 п. 0000013360 00000 п. 0000015111 00000 п. 0000016590 00000 н. 0000017893 00000 п. 0000018203 00000 п. 0000018445 00000 п. 0000018850 00000 п. 0000018924 00000 п. 0000019259 00000 п. 0000019584 00000 п. 0000020108 00000 п. 0000020405 00000 п. 0000020456 00000 п. 0000020832 00000 п. 0000020883 00000 п. 0000022106 00000 п. 0000023103 00000 п. 0000024294 00000 п. 0000026981 00000 п. 0000029291 00000 п. 0000030187 00000 п. 0000034753 00000 п. 0000034788 00000 п. 0000034824 00000 п. 0000035992 00000 п. 0000036260 00000 п. 0000485404 00000 н. 0000485497 00000 н. 0000486316 00000 н. 0000486361 00000 н. 0000488255 00000 н. 0000492933 00000 н. 0000493098 00000 н. 0000493520 00000 н. 0000494150 00000 н. 0000494732 00000 н. 0000495250 00000 н. 0000495768 00000 н. 0000496222 00000 п. 0000496692 00000 н. 0000497514 00000 н. 0000498080 00000 н. 0000498598 00000 н. 0000499644 00000 н. 0000500242 00000 н. 0000500680 00000 н. 0000500990 00000 н. 0000501860 00000 н. 0000502426 00000 н. 0000502976 00000 н. 0000503638 00000 н. 0000504220 00000 н. 0000504626 00000 н. 0000505144 00000 н. 0000505790 00000 н. 0000506088 00000 н. 0000506233 00000 н. 0000506269 00000 н. 0000511019 00000 н. 0000514938 00000 п. 0000527497 00000 н. 0000527646 00000 н. 0000528038 00000 н. 0000528110 00000 н. 0000528260 00000 н. 0000528412 00000 н. 0000528455 00000 н. 0000528601 00000 п. 0000528644 00000 н. 0000528792 00000 н. 0000528835 00000 н. 0000528981 00000 п. 0000529024 00000 н. 0000529187 00000 н. 0000529230 00000 н. 0000529376 00000 н. 0000529419 00000 н. 0000529581 00000 н. 0000529624 00000 н. 0000529788 00000 н. 0000529830 00000 н. 0000529943 00000 н. 0000529985 00000 н. 0000002336 00000 н. трейлер ] / Назад 957558 >> startxref 0 %% EOF 196 0 объект > поток hwh + ꣓I͕) | 9’oDN + fe ߃3 v% `ӓZQz» ] G / G} G} x

Что нового в Mightycause — май 2021 г.

Mightycause постоянно работает над разработкой новых инструментов и технологий для поддержки некоммерческих организаций на нашей платформе.Это часть нашей миссии как компании. Мы хотим сделать сбор средств максимально простым, удобным, рентабельным и эффективным. И мы хотим, чтобы доноры могли легко поддерживать дела, которые им дороги, с помощью беспрепятственного процесса пожертвований.

Вот что мы добавили с начала года!

Опыт донора и настройка оформления заказа

Итак, мы можем вечно говорить о стратегии сбора средств и рассказывании историй, но центральным элементом всего сбора средств является фактическое пожертвование.Никакой хороший сбор средств не может компенсировать обременительный или сложный процесс пожертвования. А для некоммерческих организаций это ключевой момент для сбора информации и усиления воздействия их работы. Вот почему мы уделяем приоритетное внимание предоставлению некоммерческим организациям возможности контролировать процесс оформления заказа в соответствии с их потребностями.

Мы внесли несколько ключевых изменений, которые дают некоммерческим организациям еще больше контроля над потоком пожертвований, в том числе:

Простое оперативное редактирование и предварительный просмотр форм пожертвований
Больше уровней пожертвований, чтобы убедиться, что у ваших жертвователей есть варианты вы хотят, чтобы у них было
ссылок для пожертвований, которые сделают сумму пожертвования по умолчанию определенной суммой, чтобы некоммерческие организации могли доставлять еще более мощные призывы к действию по электронной почте, в социальных сетях и в других местах
Возможность скрыть повторяющиеся пожертвования на определенные кампании или пожертвования страниц
По умолчанию для повторяющихся пожертвований на страницах кампании или страницах пожертвований для поддержки ваших повторяющихся усилий по благотворительной кампании

И мы также улучшили наш пользовательский интерфейс, чтобы некоммерческим организациям стало еще проще вносить эти изменения и находить настройки, которые они ищут в их дашбордах.

Дополнительные вопросы для доноров

В процессе пожертвования некоммерческие организации имеют возможность получить необходимую информацию о своих донорах. Но с большим количеством платформ для сбора средств у вас очень ограниченный (или даже нулевой) контроль над процессом. Вы должны максимально эффективно использовать данные, которые они готовы вам предоставить. Однако на Mightycause у вас есть несколько способов собрать информацию, необходимую для отслеживания, привлечения и развития ваших доноров.

В 2021 году мы предоставили всем некоммерческим организациям возможность добавлять собственные вопросы в поток пожертвований.(И это в дополнение к данным, которые некоммерческие организации уже имеют возможность собирать при оформлении заказа!) Вам нужно больше одного вопроса? Наш расширенный план позволяет задавать несколько настраиваемых вопросов в потоке пожертвований, поэтому простое обновление поможет вам создать еще более индивидуальный подход к пожертвованию.

Узнать больше

Виджет пожертвований

Виджет пожертвований Mightycause часто является тем, что привлекает некоммерческие организации на нашу платформу. Это простой и элегантный инструмент, который можно легко встроить на веб-сайт некоммерческой организации.И, как наша компания и организации, которые мы обслуживаем, она небольшая, но мощная. Доноры могут настраивать повторяющиеся пожертвования с помощью виджета, ваша некоммерческая организация может добавлять настраиваемые уровни пожертвований и описания воздействий, а также быстро обрабатывать пожертвования. Это маленький инструмент, который делает очень большие дела.

Мы упростили доступ к виджету для некоммерческих организаций, так что вы можете быстро получить код для встраивания и добавить его на любой веб-сайт или страницу по своему усмотрению. Также проще редактировать или добавлять то, что отображается в вашем виджете.Мы добавили улучшенный виджет для отслеживания пожертвований, чтобы у некоммерческих организаций было еще больше информации. А теперь вы можете использовать фирменный стиль и цвета своей некоммерческой организации, чтобы они гармонично вписывались в любое место, где бы вы их ни встраивали.

Виджет пожертвований Mightycause.

Встроенные формы для пожертвований

Виджет — это еще не все, что Mightycause может предложить! Мы также предлагаем индивидуальные встраиваемые формы для пожертвований для более комплексного и связного пожертвования. Мы добавили встроенное редактирование, чтобы некоммерческие организации могли легче вносить (и видеть) изменения, в дополнение ко всем улучшениям, которые были упомянуты ранее в работе доноров и оформлении заказа.И все они размещены прямо на вашем собственном веб-сайте, поэтому ваша форма отлично вписывается в процесс пожертвований с использованием лучших в своем классе технологий Mightycause.

Slack Integration

В 2020 году рабочие места претерпели масштабные структурные изменения в ответ на пандемию. Сотрудники некоммерческих организаций обнаружили, что они работают из дома на постоянной основе, меняя мир со своих обеденных столов и гостиных. А поскольку личные встречи и совместная работа были исключены, всем пришлось очень быстро адаптироваться к использованию новых инструментов для встреч, общения и совместной работы.Одним из таких инструментов был Slack.

Slack — это программа чата, которая позволяет рабочим местам подключаться через каналы чата, посвященные темам, личным сообщениям, групповым чатам, видеозвонкам и т. Д. Программа также позволяет настраивать оповещения, чтобы рабочее место могло быстро реагировать на определенные элементы.

Mightycause построил интеграцию со Slack, чтобы сделать удаленную совместную работу еще проще. Опытные клиенты могут настроить оповещения о пожертвовании, которые позволят вашей команде узнать, когда кто-то совершил пожертвование, чтобы вы могли отслеживать и быстро обращаться к вам, чтобы выразить свою признательность.

Получить демонстрацию

Google Analytics

Мы знаем, насколько важны данные в Mightycause. И мы хотим, чтобы некоммерческие организации, использующие нашу платформу, имели доступ к более полным данным о своих пожертвованиях и возможных спонсорах. Итак, мы создали интеграцию с Google Analytics, которая предоставит еще больше данных о том, как люди взаимодействуют со страницей вашей некоммерческой организации.

Google Analytics предоставляется бесплатно, поэтому все, что нужно сделать некоммерческим организациям, — это подписаться на наш расширенный план, настроить Google Analytics на Mightycause и добавить идентификатор отслеживания в свою панель управления.После этого вы можете расслабиться и наблюдать за потоком данных.

Подробнее о Google Analytics

Facebook Pixel

Facebook Pixel очень похож на Google Analytics, но для рекламы в Facebook. Это небольшой код отслеживания, который вы добавляете на свой веб-сайт, чтобы отслеживать действия пользователей с момента, когда они нажимают на ваше объявление. Для некоммерческих организаций, инвестирующих в рекламу в Facebook, важно знать, насколько эффективны ваши объявления, побуждая людей совершать желаемые вами действия. А для мероприятия, благотворительного дня или конкретной кампании по сбору средств некоммерческие организации могут в конечном итоге рекламировать свою страницу Mightycause.Теперь у некоммерческих организаций есть способ отслеживать активность на Mightycause через свой пиксель Facebook.

Некоммерческие организации с расширенным планом теперь могут легко добавить свой пиксель Facebook на свою страницу Mightycause, чтобы получать еще более надежные данные от пользователей.

Соответствующие гранты

Соответствующие гранты — это крупные пожертвования, которые некоммерческая организация использует в качестве стимула для других жертвователей. Думайте об этом как о продаже BOGO на пожертвования. Наиболее распространенный формат предоставления сопоставления — это совпадение 1: 1, но инструмент сопоставления грантов на Mightycause может сделать гораздо больше.У вас есть возможность убедиться, что ваш матч служит целям вашей некоммерческой организации.

Независимо от того, является ли ваша цель достижением вехи по сбору средств, привлечением уникальных доноров или просто увеличением суммы, которую вы собираете, наш инструмент совместных грантов поможет вам. У некоммерческих организаций есть возможность настраивать условия соответствия, чтобы некоммерческие организации могли максимально использовать свое совпадение, и мы добавили в это сочетание несколько новых возможностей!

Узнать больше о Mightycause

Интерлейкин-10 и аллостерические регуляторы SHIP1 вызывают противовоспалительное действие посредством комплексов SHIP1 / STAT3

РЕФЕРАТ

Противовоспалительное действие интерлейкина-10 (IL10) считается опосредуется в первую очередь фактором транскрипции STAT3, но провоспалительные цитокины, такие как интерлейкин-6 (IL6), также действуют через STAT3.Теперь мы сообщаем, что IL10, но не передача сигналов IL6, индуцирует образование комплекса между STAT3 и инозитолполифосфат-5-фосфатазой SHIP1 в макрофагах. И SHIP1, и STAT3 перемещаются в ядро макрофагов. Примечательно, что сесквитерпены семейства Pelorol, которые мы ранее описали как аллостерические активаторы активности фосфатазы SHIP1, могут индуцировать образование комплекса SHIP1 / STAT3 в клетках и имитировать противовоспалительное действие IL10 на мышиной модели колита. Используя кристаллографию и исследования докинга, мы идентифицировали карман, связывающий лекарство, в SHIP1.Наши исследования раскрывают новые механизмы действия как STAT3, так и SHIP1, и дают обоснование для использования аллостерических соединений, активирующих SHIP1, которые имитируют полезное противовоспалительное действие IL10.

ВВЕДЕНИЕ

Распространенность воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) в Северной Америке составляет 505/100 000 человек (язвенный колит) и 322/100 000 человек (болезнь Крона) и продолжает расти (Sairenji et al., 2017). Многие факторы способствуют развитию ВЗК, но полногеномные исследования ассоциации (Verstockt et al., 2018) и клинические данные (Engelhardt and Grimbacher, 2014, Glocker et al., 2009, Glocker et al., 2011, Louis et al., 2009) показывают противовоспалительное действие интерлейкина-10 (IL10) (Friedrich et al. al., 2019, Ouyang and O’Garra, 2019, Ouyang et al., 2011) важны для поддержания надлежащего иммунного гомеостаза. У мышей с дефицитом IL10 развивается колит, аналогичный воспалительному заболеванию кишечника человека (Kuhn et al., 1993, Shouval et al., 2014b), а ключевой мишенью IL10 является макрофаг (Friedrich et al., 2019, Shouval et al., 2014b, Zigmond et al., al., 2014). У людей полиморфизмы в гене IL10 связаны с язвенным колитом (Louis et al., 2009), а гомозиготные мутации с потерей функции в субъединицах рецептора IL10 приводят к раннему началу колита (Engelhardt and Grimbacher, 2014, Glocker et al. , 2009, Glocker et al., 2011). Следовательно, понимание механизма, с помощью которого IL10 оказывает свое действие на клетки-мишени, может дать представление о разработке терапевтических средств для лечения воспалительного заболевания (Kumar et al., 2017).

IL10 поддерживает иммунный гомеостаз слизистой оболочки толстой кишки, главным образом, путем ингибирования макрофагами продукции медиаторов воспаления, таких как фактор некроза опухоли α (TNFα) и IL1α, вызванный воспалительными стимулами (Friedrich et al., 2019, Ouyang and O’Garra, 2019, Ouyang et al., 2011, Shouval et al., 2014a, Zigmond et al., 2014, Iyer and Cheng, 2012). В классической модели передачи сигналов рецептора IL10 связывание IL10 с его рецептором вызывает активацию тирозинкиназы Jak1 и Tyk2, фосфорилирование тирозина фактора транскрипции STAT3 и экспрессию генов, регулируемых STAT3 (Hutchins et al., 2013, Murray, 2006b , Мюррей, 2006a). Широко распространено мнение, что активации STAT3 достаточно для опосредования всех противовоспалительных действий IL10 (El Kasmi et al., 2006, Murray, 2005, Murray, 2006b, Murray, 2006a, Weaver et al., 2007, Hutchins et al., 2012). В подтверждение этого, у мыши, специфичной для миелоида STAT3 ^{— / —}, развивается колит (Takeda et al., 1999), как и у мыши IL10 ^{— / —} (Kuhn et al., 1993, Zigmond et al., 2014). . Однако STAT3 фосфорилируется по тирозину и активируется многими стимулами, включая провоспалительный цитокин интерлейкин-6 (IL6) (Garbers et al., 2015), поэтому активация STAT3 должна отличаться ниже по ходу передачи сигналов IL10 и IL6, чтобы опосредовать их противоположные действия. .

SHIP1-фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат-5-фосфатаза представляет собой цитоплазматический белок, экспрессируемый преимущественно в гематопоэтических клетках (Hibbs et al., 2018, Fernandes, 2013 # 1400, Huber et al., 1999, Krystal, 2000, Pauls и Маршалл, 2017). В ответ на внеклеточные сигналы SHIP1 может рекрутироваться на клеточную мембрану, и одним из его действий может быть отключение передачи сигналов фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) (Brown et al., 2010) путем дефосфорилирования продукта PI3K PIP3 в PI (3 , 4) P ₂ (Fernandes et al., 2013, Huber et al., 1999, Krystal, 2000, Pauls and Marshall, 2017). Мы показали, что активность фосфатазы SHIP1 аллостерически активируется ее продуктом PI (3,4) P ₂ и что небольшие молекулы семейства пелоролов (ZPR-MN100 и ZPR-151) также аллостерически усиливают активность фосфатазы SHIP1 (Meimetis et al. ., 2012, Онг и др., 2007). Эти данные предполагают, что стимуляция активности фосфатазы SHIP1 с помощью низкомолекулярных активаторов SHIP1 может быть использована для лечения воспалительных заболеваний, вызванных ненадлежащим образом длительной выработкой PI3K PI (3,4) P ₂.

Однако, помимо своей ферментативной функции по гидролизу PIP3, SHIP1 также может действовать как стыковочный белок для сборки сигнальных комплексов (Pauls and Marshall, 2017). Ранее мы показали, что передача сигналов IL10R требует, чтобы SHIP1 ингибировал трансляцию TNFα (Chan et al., 2012), но работают ли SHIP1 и STAT3 независимо или вместе, не было определено. Теперь мы сообщаем, что белок SHIP1, содержащий точечные мутации, который инактивирует его фосфатазную активность, все еще может опосредовать противовоспалительное действие IL10, и что SHIP1 и STAT3 связываются друг с другом в ответ на IL10.Кроме того, низкомолекулярные аллостерические активаторы SHIP1 могут сами по себе индуцировать образование комплекса SHIP1 / STAT3 и ингибировать воспаление в модели колита у мышей.

Эти данные предполагают, что агонисты SHIP1 могут быть использованы для индукции полезного противовоспалительного действия IL10 путем индукции конформационного изменения в SHIP1, которое делает возможным образование комплекса SHIP1 / STAT3.

Более того, признаки заболевания, при которых происходит потеря нормальной функции IL10, могут быть наиболее полезными при использовании агонистов SHIP1.

РЕЗУЛЬТАТЫ

IL10 требует, чтобы SHIP1 и STAT3 подавляли продукцию TNFα макрофагами.

Роль STAT3 в опосредовании ингибирования IL10 TNFα in vivo была впервые описана Takeda et al. (Takeda et al., 1999) . Они обнаружили, что введение LPS мышам с миелоидно-специфическим нокдауном STAT3 продуцировало больше TNFα, чем мыши дикого типа, и пришли к выводу, что эндогенный IL10 неспособен противодействовать передаче сигналов LPS у мышей STAT3 ^{— / —}. Однако более тщательное изучение их данных показало, что, хотя уровни TNFα остаются высокими после введения LPS у мышей IL10 ^{— / —} (Berg et al., 1995), уровни TNFα падают у мышей STAT3 ^{— / —} по мере роста эндогенных уровней IL10 (Takeda et al , рис. 2B). Это означает, что белок, отличный от STAT3, может вносить вклад в действие IL10. Наши предыдущие исследования на основе клеточных культур подтвердили, что SHIP1 участвует в действии IL10 (Chan et al., 2012, Cheung et al., 2013, Samiea et al., 2020). Теперь мы проверили in vivo способность IL10 ингибировать LPS-индуцированную экспрессию воспалительных цитокинов ( Рисунок 1A ) у мышей SHIP1 ^{+ / +} и SHIP1 ^{— / —} и обнаружили, что IL10 ингибирует TNFα в SHIP1 ^{. + / +}, но не SHIP1 ^{— / —} мышей.Ранее мы показали, что активность фосфатазы SHIP1 аллостерически стимулируется ее продуктом PI (3,4) P ₂ (Ong et al., 2007). Мы синтезировали низкомолекулярный аллостерический регулятор, ZPR-MN100 (ранее называвшийся AQX-MN100 (Ong et al., 2007)) ( Рисунок 7A ), который связывается с тем же доменом SHIP1 C2, что и PI (3,4) P ₂ и увеличивает функциональную активность SHIP1 (Ong et al., 2007). Мы обнаружили, что ZPR-MN100 ингибирует LPS-индуцированный TNFα у мышей SHIP1 ^{+ / +}, но не SHIP1 ^{— / —}, предполагая, что эти соединения могут имитировать противовоспалительные свойства IL10 и действительно специфичны для SHIP1 ( Рисунок 1B ).

Рисунок 1. IL10 использует SHIP1 и STAT3 для подавления активации макрофагов.

Сывороточный TNFα у мышей SHIP1 ^{+ / +} или SHIP1 ^{— / —}, которым внутрибрюшинно вводили LPS, LPS + IL10 (A) или LPS + ZPR-MN100 (B) в концентрациях, указанных для 1 час. Данные представляют собой средние значения n≥4. * p <0,05, ** p <0,01 при сравнении с мышами, стимулированными только LPS, ns = несущественно. (C) STAT3 ^{+ / +}, STAT3 ^{— / —}, SHIP1 ^{+ / +} и SHIP1 ^{— / —} — макрофаги, полученные из костного мозга (BMDM), стимулировались LPS (пунктирная линия) или LPS. + IL10 (сплошная линия) в течение 180 минут в проточном аппарате.Фракции собирали каждые 5 минут для измерения уровней TNFα. Данные представляют два независимых эксперимента.

Рис. 2. IL10 вызывает физическую ассоциацию SHIP1 и STAT3.

(A) J17 SHIP1 ^{— / —} Клетки, экспрессирующие либо His ₆ -SHIP1, либо His ₆ -SHIP1 3PT, тестировали на их способность ингибироваться IL10 в анализе продукции TNFα, стимулированной LPS. (B) J17 His _{6 клеток} -SHIP1 стимулировали IL6, IL10 или ZPR-151 в течение 5 минут.His ₆ -SHIP1 удаляли с помощью никелевых шариков и вместе с клеточными лизатами зондировали антителами SHIP1, STAT3 и фосфо-STAT3. (C) Одноклеточный FRET-анализ клеток J17 SHIP1 ^{— / —}, экспрессирующих конструкции слияния пар FRET, Clover-SHIP1 и mRuby2-STAT3, «ложно» стимулированных или стимулированных IL6, IL10, ZPR-151 в течение 1 минуты. Эффективность FRET определялась методом акцепторного фотообесцвечивания. Данные представляют собой% эффективности FRET отдельных клеток по крайней мере из трех независимых экспериментов для каждой обработки (однофакторный дисперсионный анализ с поправкой Тьюки, **** p <0.0001).

SHIP1 и STAT3 могут действовать независимо или вместе, опосредуя действие IL10. Чтобы помочь различить эти две возможности, мы использовали систему непрерывного проточного культивирования клеток, которая позволяет нам оценить кинетику продукции TNFα в SHIP1 и STAT3 дикого типа и макрофагах, полученных из костного мозга (BMDM). LPS стимулирует два пика экспрессии TNFα, один примерно через 1 час, а другой через 3 часа ( Рисунок 1C ). IL10 снижает уровни TNFα как в клетках SHIP1 ^{+ / +}, так и в STAT3 ^{+ / +}, но полностью нарушает ингибирование 1-часового пика как в клетках STAT3 ^{— / —}, так и в SHIP1 ^{— / —}, и частично нарушено ингибирование 3-часового пика в обоих KO BMDM.Идентичные паттерны невосприимчивости предполагают, что SHIP1 и STAT3 взаимодействуют.

IL10 индуцирует физическую ассоциацию SHIP1 и STAT3 в макрофагах

Наше открытие, что SHIP1 и STAT3 работают вместе, беспрецедентно. Оба белка находятся в цитоплазме покоящихся клеток и рекрутируются на клеточную мембрану в ответ на внеклеточные стимулы, но с помощью различных механизмов. STAT3 функционирует в основном как фактор транскрипции (Matsuda et al., 2015), а SHIP1 наиболее известен своей липид-фосфатазной активностью (Pauls and Marshall, 2017).Однако SHIP1 также может действовать как стыковочный или адаптерный белок для сборки сигнальных комплексов (Pauls and Marshall, 2017). Действительно, мы обнаружили, что версия SHIP1 с минимальной активностью фосфатазы (3PT) (An et al., 2005) может опосредовать ингибирующий эффект IL10 на LPS-стимулированную продукцию TNFα (, рис. 2A, ), поэтому мы исследовали, может ли SHIP1 выполняют функцию адаптера в передаче сигналов IL10 и связываются с STAT3 в ответ на IL10. На фиг. 2B показано, что обработка клеток IL10 приводила к соосаждению SHIP1 с STAT3.IL6 не может индуцировать ассоциацию STAT3 с SHIP1, хотя STAT3 становится фосфорилированным по тирозину в той же степени, что и в ответ на IL10. Примечательно, что обработка клеток низкомолекулярным аллостерическим регулятором SHIP1 ZPR-151 (ранее называвшимся 28 · HCl (Meimetis et al., 2012)), более водорастворимым производным ZPR-MN100 ( Рисунок 7A ), является достаточно, чтобы вызвать ассоциацию SHIP1 и STAT3 ( Рисунок 2B ). Способность ZPR-151 индуцировать ассоциацию SHIP1 и STAT3 предполагает, что связывание ZPR-151 может вызывать конформационные изменения, которые могут изменять ассоциацию SHIP1 с другими белками.Чтобы увидеть, происходит ли взаимодействие SHIP1 / STAT3 в интактных клетках, мы создали конструкции слитых белков Clover-SHIP1 и mRuby2-STAT3 и трансдуцировали их в клетки J17 SHIP1 ^{— / —} для анализа FRET. На рис. 2C показано, что стимуляция клеток Clover-SHIP1 / mRuby2-STAT3 с помощью IL10 или ZPR-151, но не IL6, увеличивает сигнал FRET Clover-mRuby2, предполагая, что SHIP1 и STAT3 взаимодействуют in vivo .

И SHIP1, и STAT3 имеют домены Sh3, и сообщалось, что оба они фосфорилируются по остаткам тирозина, поэтому образование комплекса может быть опосредовано взаимодействием фосфотирозин / Sh3.Поскольку Рисунок 2B показывает, что STAT3 не нужно фосфорилировать для связывания с SHIP1 (см. Дорожку ZPR-151), мы посмотрели, могут ли остатки тирозина на SHIP1 фосфорилироваться для взаимодействия с доменом STAT3 Sh3. Четыре остатка тирозина в SHIP1 существуют в контексте последовательности узнавания домена Sh3 STAT3. Мы сконструировали мутанты SHIP1, в которых каждый из этих остатков заменен фенилаланином, экспрессировали их в клеточной линии макрофагов J17 SHIP1 ^{— / —} и протестировали способность IL10 ингибировать экспрессию TNFα ( Рисунок 3A ) в этих клетках.Клетки, экспрессирующие мутант Y190F, вели себя как клетки SHIP1 ^{— / —} (, фиг. 3A, ). Способность мутанта Y190F взаимодействовать с STAT3 была снижена в 2 раза в ответ на IL10 и ZPR-151 ( Рисунок 3B и 3C ), предполагая, что часть взаимодействия SHIP1 со STAT3 требует фосфорилирования SHIP1 Y190.

Мы также изучили субклеточную локализацию SHIP1 и STAT3 в первичных клетках. Перитонеальные макрофаги дикого типа, SHIP1 ^{— / —} или STAT3 ^{— / —} стимулировали IL10 или ZPR-151 и окрашивали антителами против SHIP1 или STAT3. Фигура 4A и фигура 4B показывает индуцированную IL10 или ZPR-151 мембранную ассоциацию как SHIP1, так и STAT3 через 2 мин в клетках дикого типа. SHIP1 не перемещается в клетках STAT3 ^{— / —}, а STAT3 не перемещается в клетках SHIP1 ^{— / —} ( Рисунок 4B ). Через 20 мин и SHIP1, и STAT3 обнаруживаются в ядре клеток дикого типа, и клетки требуют транслокации для экспрессии как STAT3, так и SHIP1. Таким образом, ZPR-151 может имитировать IL10 в отношении транслокаций SHIP1 и STAT3.

Рисунок 3. SHIP1 Y190 участвует в формировании комплекса SHIP1 и STAT3.

(A) Продукция TNFα 1 нг / мл LPS + IL10, стимулированная J17 SHIP1 ^{— / —} клеток, восстановленных с помощью WT или мутантного SHIP1 или вектора (нет), определенного с помощью ELISA, на основании которого были рассчитаны значения IC50 для IL10 (один- Метод ANOVA с поправкой Даннета **** p <0,0001). (B) Клетки, экспрессирующие WT или Y190F SHIP1, стимулировали IL10 или ZPR-151 в течение 5 минут. His ₆ -SHIP1 удаляли с использованием никелевых шариков и вместе с клеточными лизатами зондировали SHIP1, STAT3 и фосфо-STAT3 и антителами к актину. (C) Количество белка STAT3, разрушенного His ₆ -SHIP1 (WT или Y190F), определяли количественно (двухфакторный дисперсионный анализ с поправкой Сидака, ** p <0,01, * p <0,05).

Рисунок 4. IL10 индуцирует ядерную транслокацию SHIP1 и STAT3.

(A) STAT3 ^{+ / +} и SHIP1 ^{+ / +} перимаков стимулировали IL10 или ZPR-151 в течение 2 или 20 минут и окрашивали CD11b, антителами SHIP1 и STAT3 и DAPI, как указано. Данные для перимаков SHIP1 ^{— / —} и STAT3 ^{— / —} показаны на рисунке S1. (B) Коэффициенты Пирсона были рассчитаны, чтобы показать степень перекрытия SHIP1 или STAT3 с мембранным маркером CD11b или ДНК-маркером DAPI. Данные представляют собой коэффициенты Пирсона для отдельных полей клеток по крайней мере из двух независимых экспериментов в каждом типе клеток (двухфакторный дисперсионный анализ с поправкой Сидака, **** p <0,0001, *** p <0,001, ** p <0,01, * р <0,05).

SHIP1 претерпевает конформационные изменения при связывании аллостерического регулятора

Чтобы лучше понять взаимодействие низкомолекулярных аллостерических регуляторов с SHIP1, мы создали для рентгеновской кристаллографии усеченные белки SHIP1, которые содержат минимальную область SHIP1, необходимую для аллостерической регулируемой фосфатазы. активность ( Рисунок 5 ).Полная длина SHIP1 не может быть выражена в количестве, достаточном для кристаллографии, поэтому мы сначала определили минимальную область SHIP1, необходимую для аллостерической активации. Ранее мы показали, что домен C2 связывает аллостерические регуляторы SHIP1 (PI (3,4) P ₂, ZPR-MN100), и что N-концевой домен PH-R домена может быть задействован (Ong et al. ., 2007). Итак, мы экспрессировали полноразмерный SHIP1 (который может продуцироваться только в клетках 293T млекопитающих), PPAC (который содержит домены PH-R-фосфатазы-C2 и может экспрессироваться как в клетках 293T, так и в E.coli ) и PAC1 / PAC2 (которые содержат домены фосфатазы-C2 и могут быть экспрессированы в E. coli ) белки ( Рисунок 5A ). Мы исследовали их кинетические свойства фермента (фосфатазы) и способность активироваться ZPR-MN100. Мы обнаружили, что PPAC, полученный из 293T и E.coli , обладает одинаковыми ферментативными свойствами (, рис. 5B, ), и что все четыре белка (полноразмерный SHIP1, PPAC, производный 293T, PPAC , производный E. coli , и PAC2) могут активируется ZPR-MN100 ( Рисунок 5C ).

Рисунок 5. PPAC, PAC1 и PAC2 обладают такой же ферментативной активностью, что и полноразмерный SHIP1.

(A) Принципиальная схема различных конструкций усечения SHIP1. PPAC состоит из домена PH-R, фосфатазы и домена C2 (остатки аминокислот 293-877). PAC1 и PAC2 состоят из фосфатазы и домена C2 (остатки аминокислот 402-861 и 402-857 аминокислот соответственно). PAC1-cc и PAC2-cc содержат мутации снижения поверхностной энтропии в домене C2 (E770A, E772A, E773A). Этот кластер остатков был идентифицирован с помощью сервера поисковой выдачи (http: // services.mbi.ucla.edu/SER/intro.php). (B) Начальные каталитические скорости ферментов определяли при указанных концентрациях IP ₄. Значения K _cat и K _m были рассчитаны с использованием программного обеспечения GraphPad (C) Способность ZPR-MN100 стимулировать активность фосфатазы в полноразмерных SHIP1, PPAC и PAC (двухфакторный дисперсионный анализ с поправкой Тьюки для множественных сравнений, * * p <0,01, **** p <0,0001).

Только белки PAC1 и PAC2 могли быть экспрессированы в количествах, необходимых для структурных исследований, поэтому их производили и пропускали через фильтры для условий получения кристаллов достаточного качества для определения структуры.Это включало уменьшение поверхностной энтропии (Derewenda, 2004, Goldschmidt et al., 2007) версий, называемых PAC1-cc и PAC2-cc, где три остатка глутаминовой кислоты в PAC1 и PAC2 были заменены аланинами. Мы решили структуру для нескольких кристаллов PAC1-cc и PAC2-cc, и данные для кристалла PAC2-cc, дифрагировавшего с разрешением 1,6 Å, показаны на рис. 6A и в таблице S1 . Мы также использовали данные малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) для создания моделей PAC1 с ZPR-MN100 и без него.Конформация раствора безлигандированного PAC1, определенная методом SAXS, подтверждает рентгеновскую кристаллическую структуру. Кроме того, анализ SAXS показал, что связывание ZPR-MN100 с PAC1 приводит к изменению его общей конформации ( Рисунок 6B) .

Рисунок 6. SHIP1 претерпевает конформационные изменения при связывании аллостерического регулятора.

(A) Модель PAC2 на основе данных кристаллографии. Предполагаемый карман связывания для ZPR-MN100 (розовая диаграмма) расположен на границе раздела между доменами C2 (синий) и фосфатазы (желтый).Связывающий карман имеет аминокислотные остатки K681 в непосредственной близости от ZPR-MN100. (B) SAXS-модель PAC1 в отсутствие (апо-PAC1) и в присутствии лигандированного ZPR-MN100. (C) Данные биослойной интерферометрии (BLI) сенсоров, нагруженных PAC2 WT и K681A, подвергнутых воздействию 20 мкМ ZPR-151 или PI (3,4) P ₂. **** p <0,0001 при сравнении WT PAC2 и K681A (непарный t-критерий Стьюдента) (D) Продукция TNFα 10 нг / мл стимулированных LPS + IL10 клеток, восстановленных WT или K681A SHIP1 или отсутствием (SHIP1 KO), определенная ELISA, на основании которого рассчитывали значения IC50 для IL10.**** p <0,0001 при сравнении с клетками, восстановленными с помощью WT SHIP1 (непарный t-критерий Стьюдента). См. Также рисунок S2 и таблицу S1.

Используя молекулярное моделирование (Ban et al., 2018), мы идентифицировали потенциальный карман связывания для ZPR-MN100 / ZPR-151 в PAC2 ( Рисунок 6A) . Предполагается, что остаток K681 в этом кармане участвует в связывании ZPR-MN100 / ZPR-151, поэтому мы создали точечный мутант K681A для PAC2 и протестировали способность дикого типа и PAC2-K681A связывать ZPR-151 с использованием биослойной интерферометрии (BLI ).Как показано на Рисунок 6C (и Рисунок S2) , замена K681A в предполагаемом кармане ухудшает способность ZPR-151 и PI (3,4) P ₂ связываться с PAC2. Затем мы изучили влияние замены K681A на способность полноразмерного SHIP1 опосредовать ингибирование макрофагов IL10. На фигуре 6D показано, что IL10 эффективно ингибирует продукцию TNFα в клетках, экспрессирующих K681A SHIP1 дикого типа.

В работе, выполненной независимо от авторов этой статьи, Стентон и др. описали молекулу под названием AQX-1125 (структура на фиг. , рис. 7А , позже получившая название клинического испытания Rosiptor) в качестве агониста SHIP1 (Stenton et al. ., 2013a, Stenton et al., 2013b). Однако AQX-1125 / Rosiptor обладает маргинальной активностью по увеличению фосфатазы SHIP1 (Stenton et al., 2013b) и демонстрирует свойства кинетики фермента, отличные от свойств ZPR-MN100 (Stenton et al., 2013b), которые мы наблюдали с ZPR-MN100 (Ong et al., 2007). ). Stenton и др. изучали связывание меченного тритием AQX-1125 / Rosiptor с белком SHIP1 с помощью сцинтилляционного анализа близости, но трудно оценить значимость наблюдаемого ими сигнала ~ 300 импульсов в минуту. Итак, мы напрямую сравнили способность PI (3,4) P ₂., ZPR-151 и AQX-1125 / Rosiptor для связывания с SHIP1 в нашем анализе BLI ( Рисунок 7B и Рисунок S2 ). Мы обнаружили, что AQX-1125 / Rosiptor очень плохо связывается с SHIP1 по сравнению с ZPR-151 или природным агонистом SHIP1 PI (3,4) P ₂ ..

Рис. 7. Связывание AQX-1125 / Rosiptor с PAC2 слабое по сравнению с ЗПР-151 и ПИ (3,4) П ₂.

(A) Конструкции ZPR-MN100 и его производной ZPR-151, а также AQX-1125 / Rosiptor. (B) Типичные кривые биослойной интерферометрии (BLI) для связывания 20 мкМ ZPR-151, AQX-1125 и PI (3,4) P ₂ с PAC2 дикого типа (WT).Каждая точка данных указывает данные от независимого биосенсора (односторонний дисперсионный анализ с поправкой Тьюки *** p <0,001, ** p <0,01). См. Также рисунок S2.

Низкомолекулярный аллостерический регулятор SHIP1 ZPR-MN100 облегчает воспаление при IL10

^{— / —} колит

Чтобы проверить, могут ли низкомолекулярные аллостерические регуляторы SHIP1 имитировать противовоспалительное действие IL10 in vivo , мы исследовали, действительно ли ZPR -MN100 может уменьшить воспаление в модели колита у мышей с нокаутом IL10 (Keubler et al., 2015). У мышей с нокаутом IL10 развивается колит при колонизации нормальной кишечной флорой, потому что IL10 необходим для сдерживания иммунного ответа хозяина на кишечные комменсальные бактерии (Keubler et al., 2015, Kuhn et al., 1993). Мы инициировали колит у мышей IL10 ^{— / —}, инокулировав их свежевыделенным содержимым толстой кишки нормальных мышей, свободных от специфических патогенов, и позволили воспалению развиться в течение 6 недель (Sydora et al., 2003). Затем мышей лечили в течение 3 недель носителем, 2 мг / кг ZPR-MN100 или 0.4 мг / кг дексаметазона (противовоспалительный стероидный препарат, используемый в качестве положительного контроля) перед забором ткани толстой кишки для анализа. Окрашенные гематоксилином и эозином срезы получали из проксимального, среднего и дистального отделов толстой кишки мышей, а также из мышей, не инокулированных флорой (группа без колита) (, фиг. 8A, ). Два исследователя, не имевшие сведений о группах лечения, оценивали срезы на основании отека подслизистой оболочки, инфильтрации иммунных клеток, наличия бокаловидных клеток и целостности эпителия ( Рисунок 8B ).В трех группах, в которых был индуцирован колит, группы дексаметазона и ZPR-MN100 имели значительно более низкие баллы патологии, чем группа носителя (, фиг. 8B, ). РНК получали из толстой кишки всех четырех групп для анализа экспрессии IL17 и CCL2, медиаторов воспаления, повышенных при колите (Lee et al., 2007). Как показано на фигуре , фиг. 8C , лечение как ZPR-MN100, так и дексаметазоном значительно снижало уровни мРНК IL17 и CCL2. Эти данные показывают, что лечение ZPR-MN100 может уменьшить воспаление при колите, возникающем в результате потери IL10.

ОБСУЖДЕНИЕ

IL6 и IL10 обладают противоположным про- и противовоспалительным действием соответственно на макрофаги (Garbers et al., 2015, Yasukawa et al., 2003), но оба цитокина стимулируют фосфорилирование тирозина STAT3 Y705 в клетках. Мы обнаружили, что IL10, но не IL6, индуцирует ассоциацию STAT3 с SHIP1, и предположили, что это различие может способствовать тому, почему STAT3 может опосредовать про- и противовоспалительные ответы ниже по течению обоих цитокинов. Возможно, индуцированная IL10 передача сигналов SHIP1 / STAT3 поддерживает противовоспалительные ответы, тогда как индуцированные IL6 димеры STAT3 / STAT3 поддерживают провоспалительные ответы.Yasukawa et al. , исследование клеток, нокаутировавших SOCS3, показало, что продолжительность активации STAT3 в макрофагальных клетках может лежать в основе противоположных биологических эффектов IL10 и IL6 (Yasukawa et al., 2003). Наши данные совместимы с их данными, поскольку активация STAT3 также может быть продлена путем его ассоциации с SHIP1.

В наших исследованиях с раскрытием SHIP1 использовалась конструкция SHIP1 с N-концевой меткой His ₆, трансдуцированная в линию клеток SHIP ^{— / —}. Нам не удалось совместно преципитировать SHIP1 и STAT3 с какими-либо другими антителами SHIP1 (все они направлены на другие области SHIP1).Это предполагает, что N-конец SHIP1 доступен в комплексе SHIP1 / STAT3. Предостережения относительно использования клеточных линий, трансдуцированных с помощью His ₆-меченого SHIP1, включают возможную экспрессию SHIP1 до более высоких уровней, чем наблюдаемые в клетках дикого типа. Однако, как показано на рис. S3 , уровень SHIP1 с меткой His ₆ аналогичен уровню SHIP1 в ячейках SHIP ^{+ / +}. Еще одно предостережение заключается в том, что ассоциации, наблюдаемые в эксперименте in vitro с понижением , могут не возникать в интактных клетках.Однако мы смогли использовать FRET, чтобы показать, что SHIP1 с меткой Clover и STAT3 с меткой mRuby2 связываются в клетках в ответ на IL10 или ZPR-151 (, рис. 2C, ). Будущие исследования включают создание антител к N-концу SHIP1 для изучения эндогенного SHIP1. Нас интересует, как передача сигналов IL10R приводит к тому, что SHIP1 работает с STAT3, а рецептор IL6 — нет. Мы также изучим, индуцирует ли комплекс SHIP1 / STAT3 экспрессию противовоспалительных генов, или присутствие SHIP1 в ядре мешает экспрессии индуцированных IL6, регулируемых STAT3 генов.

Ранее мы показали, что низкомолекулярные агонисты SHIP1 обладают противовоспалительным действием in vitro (Meimetis et al., 2012, Ong et al., 2007), и приписали эти действия стимуляции фосфатазы SHIP1 дефосфорилированию продукта PI3K PIP3. в PI (3,4) P ₂ (Fernandes et al., 2013, Huber et al., 1999, Krystal, 2000, Pauls and Marshall, 2017). Однако наши текущие данные демонстрируют, что белок SHIP1 с необнаруживаемой активностью фосфатазы достаточен для опосредования противовоспалительного эффекта IL10, поэтому адапторная функция SHIP1 может сама по себе поддерживать действие IL10.Наши анализы SAXS предполагают, что связывание агонистов SHIP1 с SHIP1 вызывает конформационные изменения в SHIP1. Это конформационное изменение может позволить SHIP1 взаимодействовать с STAT3, а комплекс SHIP1 / STAT3 перемещаться в ядро. Мы решили структуру минимального домена (PAC1 / 2) SHIP1, необходимого для опосредования аллостерического действия агонистов SHIP1, и идентифицировали карман связывания лекарственного средства с помощью молекулярного стыковочного анализа. Мутация остатка, который, как предполагается, участвует в связывании с ZPR-151, отменяет связывание ZPR-151 и способность SHIP1 опосредовать ингибирование IL10 экспрессии TNFα в макрофагах.

Мы обнаружили, что SHIP1 Y190 способствует способности SHIP1 связываться со STAT3. Способность мутанта Y190F взаимодействовать с STAT3 была снижена в 2 раза по сравнению с SHIP1 дикого типа (, фиг. 3B, ). Однако способность SHIP1 Y190F поддерживать ингибирование IL10 TNFα полностью нарушена (, фиг. 3A, ). Одна из интерпретаций заключается в том, что частичное ингибирование комплекса SHIP1 / STAT3 является физиологически значимым, поскольку ингибирование TNFα полностью отменяется. Альтернативно, образование комплекса SHIP1 / STAT3 является только одной функцией Y190.Примечательно, что агонист SHIP1 ZPR-151 сам по себе может индуцировать образование комплекса SHIP1 / STAT3. Добавление ZPR-151 к перимакам может также вызывать транслокацию SHIP1 и STAT3 в ядро. Вместе эти данные предполагают, что действие агонистов SHIP1 включает как их способность стимулировать активность фосфатазы SHIP1, так и индуцировать ассоциацию SHIP1 с STAT3.

Обработки макрофагов ZPR-151 / ZPR-MN100 было достаточно, чтобы вызвать противовоспалительные эффекты, аналогичные таковым IL10 in vitro в этом и наших предыдущих исследованиях (Chan et al., 2012, Cheung et al., 2013, Ong et al., 2007). Таким образом, мы протестировали ZPR-MN100 на мышиной модели колита, поскольку полезное противовоспалительное действие IL10 при колите проявляется через действие IL10 на макрофаги (Friedrich et al., 2019, Ouyang and O’Garra, 2019, Shouval et al., 2014b, Zigmond et al., 2014). Мы обнаружили, что ZPR-MN100 так же эффективен, как и дексаметазон, в снижении гистологических и молекулярных маркеров воспаления толстой кишки. Группа Меджитова недавно сообщила о стимуляции митофагии IL10 и инактивации инфламмасомы как части его защитного действия при колите, и что это связано с STAT3-зависимой активацией белка DDIT4 (Ip et al., 2017). Мы подтвердили, что для активации DDIT4 в макрофагах необходимы как STAT3, так и SHIP1; кроме того, ZPR-151 сам по себе был способен индуцировать экспрессию DDIT4 (рукопись готовится).

Низкомолекулярный аллостерический регулятор SHIP1 (AQX-1125 / Rosiptor) (Stenton et al., 2013a, Stenton et al., 2013b), разработанный независимо от авторов этой рукописи, недавно прошел клинические испытания для облегчения боли в мочевом пузыре. у пациентов с интерстициальным циститом (ИК) (Nickel et al., 2016). Сообщается, что IC был выбран для показания к заболеванию, потому что: AQX-1125 / Rosiptor накапливается в мочевом пузыре (Stenton et al., 2013b), в двух статьях упоминается PI3K-зависимое воспаление при IC (Liang et al., 2016, Qiao et al. , 2014), и предварительные испытания фазы 2 казались многообещающими (Nickel et al., 2016). Однако в ходе исследования фазы 3 не удалось продемонстрировать эффективность AQX-1125 / Rosiptor (Nickel et al., 2019). Есть много причин, по которым низкомолекулярные препараты не работают в процессе разработки лекарств.Однако мы отмечаем, что ни IL10, ни SHIP1 не участвуют в физиологии / патофизиологии IC (Nickel et al., 2019). Кроме того, мы обнаружили, что AQX-1125 / Rosiptor очень слабо связывается с SHIP1, что согласуется с выводами Стентона и др. , что AQX-1125 обладает очень слабой способностью активировать фосфатазу SHIP1 (Stenton et al., 2013b).

Мы предполагаем, что показаниями к заболеванию, для которых разработаны маломолекулярные аллостерические регуляторы SHIP1, должны быть показания, при которых IL10) (Friedrich et al., 2019, Ouyang and O’Garra, 2019, Ouyang et al., 2011) (или других физиологических регуляторов SHIP1) (Hibbs et al., 2018, Chan et al., 2012, Cheung et al., 2013, Dobranowski and Sly, 2018, Pauls and Marshall, 2017), как было показано, играют полезную роль. Эти небольшие молекулы также должны иметь свойства связывания, подобные SHIP1, как его природный лиганд PI (3,4) P ₂. В соответствии с этими критериями следует изучить низкомолекулярные агонисты SHIP1, такие как агонисты семейства Pelorol, для лечения воспалительного заболевания кишечника человека.

ВКЛАД АВТОРА

Вклад: TCC, STC, JSJY и ALM разработали и выполнили исследования, проанализировали данные и написали рукопись. SS, AS, DS, SAM и KJ провели эксперимент (ы) и проанализировали данные. BRG собрала и проанализировала кристаллографические данные. GK, CJO, JP, ZPR, SAM и FVP предоставили реагенты и помогли в подготовке рукописи.

Раскрытие информации о конфликте интересов: ALM, RA, CO и GK были научными основателями Aquinox Pharmaceuticals, но не были связаны с компанией и не получали компенсацию от компании с 2010 года.

КОНТАКТ ДЛЯ ОБМЕНА РЕАГЕНТАМИ И РЕСУРСАМИ

Дополнительную информацию и запросы на ресурсы и реактивы следует направлять ведущему контактному лицу, Алисе Муи (alice.mui {at} ubc.ca), и выполнять ее.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ И ДЕТАЛИ ОБЪЕКТА

Колонии мышей

Мышей BALB / c дикого типа (^{+ / +}) или мышей с нокаутом SHIP1 (^{— / —}) предоставил доктор Джеральд Кристал (BC Cancer Research Center, Ванкувер, Британская Колумбия). Генерация мышей STAT3 ^{— / —} началась с скрещивания мышей C57BL / 6 STAT3 flox / flox (Dr.Шизуо Акира, Медицинский колледж Хиого, Нисиномия, Япония) с мышами C57BL / 6 LysMcre (лаборатория Джексона). Затем их потомство скрещивали с гомозиготными мышами STAT3 flox / flox для получения как мышей STAT3 flox / flox / LysMCre ^+/- (называемых мышами STAT3 ^{— / —}), так и мышей STAT3 flox / flox (STAT3 ^{). + / +} мышей) в одних пометах. Всех мышей содержали в соответствии с этическими протоколами, утвержденными Комитетом по уходу за животными Университета Британской Колумбии.

Конструкции

Плазмиды экспрессии SHIP1 в FUGWBW у млекопитающих (лентивирусные) получали с использованием реакций Gateway LR из конструкций pENTR1A (Invitrogen, Burlington, ON). Плазмиду pENTR1A-His ₆ -SHIP1 WT (SHIP1 Uniprot ID Q9ES52) использовали в качестве матрицы для основанного на стандартном праймере сайт-направленного мутагенеза для создания мутантов K681A, Y190F, Y799F, Y659F и Y657F. Конструкция SHIP1, разрушенная фосфатазой (P671A, D675A и R676G в фосфатазном домене), любезно предоставлена доктором.К.С. Равичандран (Университет Вирджинии). Конструкции были подтверждены секвенированием ДНК. Затем была проведена реакция LR Gateway между конструкцией pENTR1A и FUGWBW (FUGW, в которой зеленый флуоресцентный белок был заменен кассетой Gateway, а кассета экспрессии гена устойчивости к бластицидину S была вставлена ниже кассеты Gateway (Peacock et al., 2009). Успех реакции LR был подтвержден расщеплением рестриктазой.Для экспериментов FRET на основе Clover / mRuby2 (Lam et al., 2012), pENTR1A Clover-SHIP1 был сконструирован путем вставки фрагмента Clover из pcDNA3 Clover (Addgene) на N-конец SHIP1 в pENTR1A-His ₆ -SHIP1 WT, заменяя His ₆ .pENTR1A STAT3-mRuby2 был сконструирован путем клонирования мышиного STAT3 (Uniprot ID P42227) в pENTR1A с последующей вставкой фрагмента mRuby2 из pcDNA3 mRuby2 (Addgene) на N-конец STAT3. Конструкции подтверждали секвенированием и переносили в FUGWBW, как указано выше.

Векторы экспрессии бактерий для получения рекомбинантных белков для кристаллографии и интерферометрии биослоя были созданы с помощью методологии лигазно-независимого клонирования (LIC) в векторе LIC-HMT (Van Petegem et al., 2004). Эта плазмида содержит N-концевую метку, состоящую из His ₆ и мальтозосвязывающего белка (MBP), за которым следует сайт расщепления протеазой TEV (сокращенно HMT-tag). Продукт ПЦР очищали и обрабатывали ДНК-полимеразой Т4 (качество LIC) (Novagen, Мэдисон, Висконсин) только в присутствии dCTP. Вектор LIC-HMT переваривали с помощью SspI и линеаризованную плазмиду обрабатывали ДНК-полимеразой Т4 только в присутствии dGTP. Равные объемы вставки и вектора смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут с последующей трансформацией в химически компетентный E.coli DH5α с использованием стандартного протокола теплового шока и селекции на чашках с LB-агаром, содержащим канамицин. Для создания различных мутантов PAC2 использовали стандартный сайт-направленный мутагенез. Идентичность всех плазмид подтверждали секвенированием ДНК.

Клеточные линии

Клеточные линии J16 и J17, полученные из SHIP1 ^{+ / +} и ^{— / —} BMDM соответственно, были описаны ранее (Ming-Lum et al., 2012) и культивированы в среде Mac (IMDM с добавлением 10 % (об. / об.) FCS, 10 мкМ β-меркаптоэтанола, 150 мкМ монотиогликолят и 1 мМ L-глутамин).Клетки J17, экспрессирующие конструкции His ₆ -SHIP1, Clover-SHIP1 или mRuby2-STAT3 дикого типа и мутантные, были получены с помощью опосредованного лентивирусом переноса генов, как описано (Cheung et al., 2013). Трансдуцированные клетки отбирали с помощью бластицидина 5 мкг / мл. Клетки Clover-SHIP1 и mRuby2-STAT3 дополнительно подвергали сортировке с активацией флуоресценции для отбора наиболее ярких клеток на цитометре FACS Aria II.

Выделение перитонеальных макрофагов мышей

Первичные перитонеальные макрофаги (перитонеальные макрофаги) выделяли от мышей с помощью перитонеального лаважа с 3 мл стерильного физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS) (Thermo Fisher Scientific, Nepean, ON).Perimac были собраны и перенесены на Mac.

Производство макрофагов, полученных из костного мозга

Макрофаги, полученные из костного мозга (BMDM), были получены сначала путем сбора бедренных и большеберцовых костей у мышей, а затем промывки костного мозга через иглу 26-G. Экстрагированные клетки помещали в среду Mac с добавлением 5 нг / мл CSF-1 и GM-CSF (Stem Cell Technologies, Ванкувер, Британская Колумбия) на 10-сантиметровый планшет для культивирования тканей в течение 2 часов при 37 ° C. Неприкрепленные клетки собирали и повторно высевали из расчета 9 × 10 ⁶ клеток на 10-сантиметровый планшет для культуры ткани.Затем клетки культивировали в присутствии CSF-1 и GM-CSF. Дифференцированные BMDM использовали через 7-8 дней. Все клетки поддерживали в инкубаторе с температурой 37 ° C, 5% CO ₂ и влажностью 95%.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ МЕТОДА

Культуры с непрерывным потоком

Устройство с непрерывным потоком обеспечивает постоянную стимуляцию и удаление клеточных супернатантов для определения кинетических профилей продукции цитокинов с течением времени. BMDM высевали из расчета 3 × 10 ⁵ клеток на лунку в 24-луночный планшет для культуры ткани, который был покрыт поли-L-лизином (Thermo Fisher Scientific, Nepean, ON) и промыли PBS.После инкубации в течение ночи культуральную среду удаляли и добавляли среду Лейбовица L-15 (L-15) (Invitrogen, Burlington, ON) с добавлением 3% FCS, 10 мкМ β-меркаптоэтанола и 150 мкМ монотиогликолата. Клеткам давали уравновеситься в среде L-15 в течение 1 часа перед помещением в аппарат для непрерывного потока. Стимулирующий раствор готовили в той же среде, уравновешенной при 37 ° C, и пропускали через модифицированное входное отверстие, приспособленное к скважине с помощью шприцевого насоса (New Era Syringe Pumps Inc., Фармингдейл, Нью-Йорк).Использовалась скорость потока 150 мкл в минуту. В то же время клеточные супернатанты удаляли из лунки при той же скорости потока, и фракции собирали с 5-минутными интервалами в течение 3 часов. Эти фракции анализировали на уровни секретируемого TNFα с помощью ELISA.

Количественная ПЦР в реальном времени

Суммарную РНК экстрагировали с использованием реагента Trizol (Invitrogen, Burlington, ON) в соответствии с инструкциями производителя. Около 2-5 мкг РНК обрабатывали DNAseI (Roche Diagnostics, Laval, QC) в соответствии с руководством по продукту.Для анализа экспрессии мРНК 120 нг РНК использовали в наборе для синтеза кДНК первой цепи транскриптора (Roche Diagnostics, Laval, QC), и от 0,1 до 0,2 мкл сгенерированной кДНК анализировали с помощью ПЦР в реальном времени на основе SYBR Green (в реальном времени -PCR) (Roche Diagnostics, Laval, QC) с использованием 300 нМ ген-специфических праймеров. Уровни экспрессии мРНК измеряли с помощью системы StepOne Plus RT-PCR (Applied Biosystems, Burlington, ON), и сравнительный метод Ct был использован для количественного определения уровней мРНК с использованием GAPDH в качестве контроля для нормализации.

Измерение продукции TNFα

Клетки высевали из расчета 50 × 10 ⁴ клеток на лунку в 96-луночный планшет для культивирования ткани и оставляли для прилипания в течение ночи. Среду меняли на следующий день за 1 час до стимуляции. Клетки стимулировали 1 или 10 нг / мл LPS +/- различных концентраций IL10 в течение 1 часа. Супернатант собирали и уровни секретированного белка TNFα измеряли с использованием набора BD OptEIA Mouse TNFα Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) (BD Biosciences, Mississauga, ON).Для каждого условия стимуляции использовали три лунки. Значения IC50 рассчитывали из трех независимых экспериментов, и различия в значениях IC50 IL10 для клеток, экспрессирующих мутанты SHIP1, по сравнению с белком SHIP1 WT, анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа.

Анализ фосфатазы in vitro

Анализ фосфатазы проводили в 96-луночных микротитровальных планшетах с 10 нг фермента на лунку в общем объеме 25 мкл в 20 мМ Трис-HCl, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 0,05 % Tween-20, 10 мМ MgCl2, как описано (Ong et al., 2007). Фермент инкубировали с ZPR-MN100 (растворенным в этаноле) в течение 10 минут при 23 ° C перед добавлением 50 мкМ инозитол-1,3,4,5-тетракисфосфата (IP ₄) (Echelon Bioscience Inc. , Солт-Лейк-Сити, штат Юта). Реакции давали возможность протекать в течение 10 минут при 37 ° C, и количество высвободившегося неорганического фосфата оценивали добавлением реагента малахитового зеленого и измерением оптической плотности при 650 нм. Для определения кинетики фермента использовали разные концентрации IP ₄ (0 — 300 мкМ), и реакции останавливали в разные моменты времени.Были рассчитаны начальные скорости, и K _cat и K _M были определены с использованием программного обеспечения GraphPad 6.

Анализ in vitro pull down

J17 His ₆ -SHIP1 и Y190F клетки высевали из расчета 2 × 10 ⁶ клеток на лунку в 6-луночный планшет. После инкубации в течение ночи добавляли свежие клеточные среды на 30 минут перед стимуляцией 100 нг / мл IL10, IL6 или 20 мкМ ZPR-151 в течение 5 минут. Клетки лизировали буфером для солюбилизации белков (PSB, 50 мМ Hepes, pH 7.5, 100 нМ NaF, 10 мМ пирофосфата натрия, 2 мМ NaVO4, 2 мМ молибдата натрия, 2 мМ ЭДТА), содержащего 1% октилглюкозид, 0,01 М имидазол и коктейль ингибиторов протеазы (Roche Diagnostics, Laval, QC) в течение 30 минут при 4 ° C и центрифугировали при 10000 об / мин в течение 15 минут. К супернатантам добавляли устойчивые к ЭДТА никелевые шарики (Roche Diagnostics, Laval, QC) и смесь инкубировали при 4 ° C в течение 1 часа перед вращением и промывкой шариков три раза 0,1% октилглюкозидным промывочным буфером в PSB. Образцы гранул и клеточные лизаты исходного материала разделяли на 7.5% гель SDS-PAGE.

Иммуноблоттинг

Лизаты белков разделяли на гелях SDS-PAGE и переносили на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) (Millipore, Etobicoke, ON). Мембраны блокировали и зондировали, при необходимости, следующими первичными антителами в течение ночи: SHIP1 (P1C1) (Santa Cruz Biotechnology), pSHIP1 (Y190) (Kinexus), STAT3 (9D8) (ThermoFisher Scientific), pSTAT3 (Y705) (Thermo Fisher Scientific), STAT1 (BD Transduction Laboratories), pSTAT1 (Y701) (Upstate Biotechnology), GAPDH и актин (Sigma-Aldrich).Мембраны были разработаны с использованием либо Alexa Fluor ^® 660 против IgG мыши, либо Alexa Fluor ^® 680 антител против IgG кролика (Thermo Fisher Scientific) и визуализированы с использованием LI-COR Odyssey Imager.

Акцепторный анализ FRET с фотообесцвечиванием

J17 SHIP1 ^{— / — Клетки}, экспрессирующие Clover-SHIP1 и / или mRuby2-STAT3, высевали из расчета 50 x 10 ⁴ клеток на лунку в 8-луночных μ-слайдах Ibidi (Ibidi GmbH, Мартинсрид, Германия). После инкубации в течение ночи клетки лишали сыворотки среды Mac, содержащей 1% сыворотки, в течение 3 часов перед заменой среды средой Лейбовица (L-15) (Invitrogen, Burlington, ON) с добавлением 1% сыворотки, 10 мкМ β-меркаптоэтанола, 150 мкМ монотиогликолят и 1 мМ L-глутамин для конфокальной микроскопии изображений.Клетки получали изображение на Leica SP8X на системе конфокального микроскопа DMi8 с объективом 63X / 1.3 Gly HC PL APO CS2 с использованием линии лазера белого света с длиной волны 488 нм для возбуждения донора и 555 нм для возбуждения акцептора. Фотообесцвечивание FRET-анализ выполняли путем измерения интенсивности флуоресценции донора Clover-SHIP1 до и после обесцвечивания акцептора, mRuby2-STAT3, в области «области интереса» (ROI) клеток при 100% интенсивности лазера в течение 60 кадров. Фотообесцвечивание акцептора проводили сначала в покоящихся клетках, а затем через 1 минуту после «имитации» стимуляции средой L-15 или средой L-15, содержащей 100 нг / мл IL10, IL6 или 20 мкМ ZPR-151.Интенсивность флуоресценции донора и акцептора отдельных клеток в обесцвеченной области интереса количественно оценивали до и после отбеливания. Процентная эффективность FRET рассчитывалась как% FRETeff = 100 x (D _после — D _до) / D _после, где D _до и D _после представляют интенсивность флуоресценции донора Clover-SHIP1 до и после отбеливания, соответственно. .

Иммунофлуоресценция

Perimacs высевали по 3 x 10 ⁵ клеток на лунку в 18-луночных μ-слайдах Ibidi (Ibidi GmbH, Мартинсрид, Германия) и оставляли на 3 часа перед промывкой PBS для удаления неприлипающих клетки.CD8 + Т-клетки высевали по 2 × 10 ⁶ клеток в 12-луночные планшеты для тканевых культур. Клетки стимулировали либо 100 нг / мл IL10, либо 20 мкМ ZPR-151 в течение 2 или 20 минут с последующими 3-кратными промывками PBS и фиксацией клеток в 4% параформальдегиде в течение 15 минут при комнатной температуре. Клетки инкубировали с блоком Fc против мышиного CD16 / CD32 (BD Pharmingen) в течение 1 часа с последующей инкубацией в течение ночи при 4 ° C либо с антителом против SHIP1 (P1C1) (Santa Cruz Biotechnology), либо с антителом против STAT3 (9D8). (ThermoFisher Scientific).Затем клетки инкубировали с вторичным антителом против IgG мыши (H + L) -Alexa Fluor 660 (ThermoFisher Scientific) в течение 1 часа, а затем с антителом против CD11b-FITC (BD Pharmingen) в течение 30 минут для перимаков. CD8 + Т-клетки помещали на 18-луночные μ-слайды Ibidi перед конфокальной микроскопией, и клетки хранили в среде Ibidi Mounting Media с добавлением антифадного реагента ProLong Gold с DAPI (Molecular Probes, Life Technologies). Клетки получали на Leica SP5II на конфокальном микроскопе DM6000 с увеличением 63x / 1.Объектив 4-0.6 Oil PL APO с использованием лазерных линий 405, 488 и 633 нм для возбуждения. Окончательные изображения сканировали последовательно, получая восемь Z-стопок со средним кадром четыре. Анализ совместной локализации был выполнен с использованием программного обеспечения ImageJ, сначала объединив отдельные конфокальные изображения z-стека, а затем выполнив деконволюцию и совместную локализацию с использованием плагинов CUDA deconvolution и JACoP соответственно. Значения коэффициента Пирсона были получены как измерение степени перекрытия между SHIP1 или STAT3 с CD11b (для Perimacs) или DAPI.

Мышиная эндотоксемия Модель

Группам мышей BALB / c SHIP1 ^{+ / +} и SHIP1 ^{— / —} в возрасте 6-8 недель внутрибрюшинно вводили 1 или 5 мг / кг ЛПС с совместным введением или без него. 1 мг / кг IL10 или 5 мг / кг ZPR-MN100. Кровь брали через 1 час сердечной пункцией для определения уровней цитокинов в плазме с помощью ELISA.

Колит у мышей Модель

Колит индуцировали у мышей BALB / c IL10 ^{— / —} в возрасте 6-8 недель путем введения содержимого толстой кишки обычных мышей C57BL / 6, разведенных 1:10 в PBS, через желудочный зонд.Следили за массой мышей и консистенцией фекалий, и колиту позволяли развиваться в течение 6 недель. Этанол (наполнитель) и ZPR-MN100 (3 мг / кг) разводили в питьевой воде клетки, а дексаметазон (0,4 мг / кг) вводили каждые 2 дня через желудочный зонд в течение 3 недель. В конце периода дозирования проксимальные, медиальные и дистальные срезы толстой кишки собирали для заливки парафином или хранили в RNALater (Invitrogen, Mississauga, ON) для экстракции РНК. Слайды были подготовлены, окрашены гематоксилином и эозином и установлены в отделении патологии UBC и лаборатории гистохимии.Образцам были присвоены патологические баллы двумя независимыми слепыми исследователями в соответствии с методом, описанным Madsen et al. (Madsen et al., 2001). Вкратце, воспаление толстой кишки оценивали по 4-балльной шкале, оценивая от 0 до 3 для каждого из подслизистых отеков, инфильтрации иммунных клеток, абляции бокаловидных клеток и целостности эпителиального слоя. Для анализа экспрессии мРНК срезы толстой кишки гомогенизировали и общую РНК экстрагировали, как описано выше, и анализировали с помощью ПЦР в реальном времени с использованием специфичных для генов праймеров для IL17, CCL2 и GAPDH (контроль нормализации).

Экспрессия PAC2 для кристаллографии

Вектор экспрессии

LIC-HMT-PAC2 трансформировали в клеток E. coli Rosetta (DE3) pLacI . Ночную культуру инокулировали 250-кратным разведением, чтобы начать собственно культивирование. Клетки выращивали при 37 ° C в среде LB (с добавлением 50 мкг / мл канамицина и 34 мкг / мл хлорамфеникола) при встряхивании при 225 об / мин. Когда OD ₆₀₀ достигнет примерно 0,6, культуру охлаждали до комнатной температуры перед добавлением 0.4 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) для индукции экспрессии рекомбинантного белка. Культуры оставляли в шейкере на ночь (обычно 16-18 часов) при 22 ° C, а затем собирали центрифугированием (5000 g в течение 10 минут при 4 ° C). Осадок клеток затем ресуспендировали в буфере для лизиса (20 мМ Трис-HCl pH 7,4, 350 мМ NaCl, 10 мМ TCEP, 5 мМ имидазол, с добавлением 1X коктейля с ингибиторами протеазы без ЭДТА (PIC) (Roche Diagnostics, Laval, QC) и 25 мкг / мл лизоцима) и лизировали обработкой ультразвуком (2 цикла по 2 минуты импульса) на льду.Клеточный дебрис удаляли двумя циклами центрифугирования, сначала при 5000 g в течение 15 минут при 4 ° C, а затем при 18000 об / мин в течение 30 минут при 4 ° C. Супернатант фильтровали через фильтр 0,45 мкм и загружали на аффинную колонку Talon Co ²⁺, предварительно уравновешенную буфером A (20 мМ трис-HCl, pH 7,4, 250 мМ NaCl, 1 мМ TCEP), и промывали колонкой 10. объем (CV) буфера B (буфер A + 5 мМ имидазол). Связанные белки элюировали 6 CV буфера C (буфер A + 50 мМ имидазол).

Для удаления метки HMT к элюированному белку добавляли протеазу TEV (очищенную в домашних условиях как белок с меткой His ₆), который затем подвергали диализу против буфера D (20 мМ Tris-HCl pH 7.4, 250 мМ NaCl, 1 мМ TCEP) в течение ночи при 4 ° C при осторожном перемешивании. Диализированный образец загружали в колонку с амилозой (New England Biolabs, Whitby, ON), и поток, содержащий немеченый белок, загружали в колонку Talon для удаления протеазы His ₆ -TEV. Поток из колонки Talon диализовали против буфера E (20 мМ Трис-HCl pH 7,4, 25 мМ NaCl, 1 мМ TCEP) в течение ночи при 4 ° C при осторожном перемешивании, а затем загружали в колонку ResourceQ (объем колонки 6 мл. ) (GE Healthcare, Миссиссауга, Онтарио) с последующей промывкой 3 CV буфера E.Для элюирования белка использовали буфер F (20 мМ Трис-HCl pH 7,4, 1000 мМ NaCl, 1 мМ TCEP). Градиент от 25 мМ NaCl (0% буфер G) до 200 мМ NaCl (20% буфер G) использовали через 20 CV для разделения компонентов в образце белка. Фракции анализировали с помощью SDS-PAGE. PAC2 обычно элюируется из колонки ResourceQ при ~ 130 мМ NaCl. Очищенный белок концентрировали примерно до 5-10 мг / мл с использованием концентраторов Amicon с 30K MWCO (Millipore, Etobicoke, ON) и заменяли на желаемый буфер.Для кристаллизации белка желаемый буфер содержал 50 мМ трис-HCl pH 7,4, 25 мМ NaCl и 0,5 мМ TCEP. Для биослойной интерферометрии белки HMT-PAC2, элюированные из первой колонки Talon, очищали непосредственно на колонке ResourceQ без расщепления метки HMT.

Экспрессия метки PAC2-Avi для биослойной интерферометрии

Последовательность, соответствующая метке Avi (GLNDIFEAQKIEWHE), была добавлена к c-концевому концу PAC2 в векторе, экспрессирующем LIC-HMT-PAC2, посредством стандартного рестрикционного переваривания и лигирования.Вектор экспрессии LIC-HMT-PAC2-Avi затем котрансформировали в клетки E.coli BL21 вектором экспрессии pBirAcm в молярном соотношении 1: 1. Ночную культуру инокулировали 250-кратным разведением, чтобы начать собственно культивирование. Клетки выращивали при 37 ° C в среде LB (с добавлением 50 мкг / мл канамицина и 10 мкг / мл хлорамфеникола) при скорости встряхивания 225 об / мин. Когда OD ₆₀₀ достигала примерно 0,6, к культуре добавляли 5 мМ биотина в бициновом буфере pH 8,3, чтобы получить конечную концентрацию биотина 125 мкМ.Затем культуру охлаждали до комнатной температуры перед добавлением 0,4 мМ изопропил-B-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) для индукции экспрессии рекомбинантного белка с помощью Avi-tag. Остальная часть метода идентична описанной в «Выражении PAC2 для кристаллографии».

Кристаллизация белка, сбор данных, фазирование и уточнение

Начальные результаты кристаллизации были получены путем скрининга разреженной матрицы в 96-луночных планшетах с использованием коммерчески доступных кристаллографических растворов (Qiagen, Toronto, ON).Оптимизацию условий кристаллизации проводили в формате 24-луночного планшета с использованием метода диффузии паров висячей капли. Белковые кристаллы дифракционного качества получали при 4-7 мг / мл белка при комнатной температуре с 0,1 М HEPES-NaOH pH 6,7, 20% PEG1500 и 5 мМ MgCl2. Белок PAC2-cc содержал мутации снижения поверхностной энтропии (E770A, E772A, E773A) и способствовал улучшению качества кристаллов. Уникальные фрагменты кристаллических кластеров белка вымачивали на 5-10 секунд в кристаллизационном растворе, содержащем 25% изопропанола, и мгновенно замораживали в жидком азоте.

Набор данных дифракции был собран на канале передового источника протонов (APS) 23-ID-D-GM / CA и обработан с помощью XDS через XDSGUI ⁴⁵. Фазовая проблема была решена с помощью неопубликованной структуры в качестве модели поиска в Phaser MR ⁴⁷. Первоначальная модель была доработана с помощью COOT ⁴⁸ и Refmac5 ⁴⁹. На пути к окончательной модели в Phenix было использовано уточнение занятости сайдчейнов (Adams et al., 2010), и были определены три группы TLS. Статистика сбора и уточнения данных представлена в Таблице S1 .Модель и данные были депонированы в базе данных белков ID 6DLG.

Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей

Образцы PAC1 в 190 мкМ в 50 мМ TrisHCl (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 1 мМ TCEP и 2% EtOH с 570 мкМ ZPR-MN100 и без него (6-кратный молярный избыток). Данные динамического рассеяния света (DLS) для комплексов PAC1 и PAC1-ZPR-MN100 были собраны до сбора данных SAXS, чтобы подтвердить, что все образцы имеют высокую чистоту и подходят для сбора данных. Сбор данных производился на камере с 3 отверстиями (S-MAX3000; Rigaku Americas, The Woodlands, TX), оснащенной герметичной трубкой с микрофокусом Rigaku MicroMaxþ002 (излучение Cu Kα при 1.54 Å) и оптической системы Confocal Max-Flux (CMF), работающей на 40 Вт (Rigaku). Данные по рассеянию регистрировались с помощью многопроволочного двумерного детектора диаметром 200 мм. Данные как для образцов, так и для буфера собирались в течение 3 часов для каждого образца в диапазоне 0,008 ≤ s ≤ 0,26 Å-1 и обрабатывались в соответствии с ранее описанным методом, где s = 4πsin θ / λ (Patel et al., 2011 , Patel et al., 2010, Patel et al., 2012). Нормализованное пространственное несоответствие (NSD) моделей PAC1 без лигандов и лигандов равнялось 0.6 и 1.0 соответственно.

Биослойная интерферометрия

Сродство связывания между белком PAC2 и низкомолекулярными аллостерическими регуляторами исследовали с помощью экспериментов биослойной интерферометрии (BLI) с использованием наконечников биосенсора супер-стрептавидина (SSA) и прибора Octet Red 96 (ForteBio, Fremont, CA ). Наконечники биосенсора SSA гидратировали в буфере для анализа 20 мМ Трис-HCl (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 0,5 мМ TCEP, 0,2% Tween-20 перед иммобилизацией белка. 0,5 мкг / мл белка иммобилизовали на биосенсоре SSA в течение ночи при 4 ° C.После иммобилизации белка на биосенсоре кончики блокировали 0,1% BSA в течение 90 минут с последующей 20-минутной промывкой аналитическим буфером с добавлением 1% EtOH. Кинетические измерения проводились при 30 ° C с орбитальным потоком 1000 об / мин. Базовый уровень был достигнут при использовании буфера для анализа с добавлением 1% EtOH в течение 60 с. Ассоциацию измеряли в течение 600 с при концентрации аналита 20 мкМ с последующей диссоциацией в течение 300 с в том же буфере, что и исходный уровень. Необработанные данные анализировали с помощью программного обеспечения Octet Red Data Analysis (вер.8.2). Необработанные данные были выровнены по базовой линии и вычтены с использованием как одиночного, так и двойного вычитания эталонов.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ И СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Количественную оценку полос всех иммуноблотов проводили с использованием системы визуализации LI-COR Odyssey и программного обеспечения Image Studio ^™ Lite (LI-COR Biosciences, Линкольн, штат Невада). GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., Ла-Хойя, Калифорния) использовали для выполнения всех статистических анализов. Статистические данные можно найти в подписях к рисункам.Значения представлены как средние ± стандартное отклонение. Непарные t тесты были использованы там, где это было необходимо, для получения двусторонних значений P. При необходимости выполняли односторонний или двусторонний дисперсионный анализ с соответствующими тестами множественных сравнений. Различия считались значимыми при p ≤0,05.

НАЛИЧИЕ ДАННЫХ И ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ

Данные рентгеновской кристаллографии, подтверждающие результаты этого исследования, были депонированы во Всемирном банке данных по белкам (wwPDB) под идентификационным кодом, PDB ID 6DLG.

КОНТАКТ ДЛЯ ОБМЕНА РЕАГЕНТАМИ И РЕСУРСАМИ

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарны д-ру Лауре Слай за ее критический обзор рукописи и д-ру Нада Лаллоус за ее советы по исследованиям BLI. Источники финансирования включают: Канадские институты исследований в области здравоохранения (CIHR) (MOP-84539 для ALM), Исследовательский институт канадского онкологического общества (грант Канадского онкологического общества № 017289 для ZPR) и грант NSERC Discovery для SAM.

Причины возникновения задержки психического развития

Причины возникновения ЗПР у детей

Что такое ЗПР?

Почему ЗПР возникает не у всех детей из группы риска?

Математические игры для ребенка с ЗПР

Игры для развития внимания для детей с ЗПР

Развитие речи у ребенка с ЗПР

Развитие мелкой моторики у ребенка с ЗПР

Классификация ЗПР (по Лебединской К.С.) -Методическое пространство -Начальная школа -Методические рекомендации -Меню

Задержка речевого развития – причины, симптомы, лечение и диагностика

Задержка психического развития (ЗПР)

Особенности воспитания и обучения детей с задержкой в развитии

Психофизическая характеристика детей с ЗПР

От обычных детей ребенка с ЗПР можно отличить по некоторым особенностям.

понятие, причины возникновения, структура дефекта

Сверхэкспрессия белков ZPR вызывает абаксиализацию листьев …

Происхождение нового регуляторного модуля в результате дупликации и дегенерации фактора транскрипции древнего растения

Основные моменты

Реферат

Сокращения

Ключевые слова

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

Белок выживания мотонейронов использует свой ZPR для ядерной локализации

Инфекция COVID-19 увеличивает риск преэклампсии, о чем сообщили исследователи WSU и PRB — School of Medicine News

Что нового в Mightycause — май 2021 г.

Опыт донора и настройка оформления заказа

Дополнительные вопросы для доноров

Виджет пожертвований

Встроенные формы для пожертвований

Slack Integration

Google Analytics

Facebook Pixel

Соответствующие гранты

Интерлейкин-10 и аллостерические регуляторы SHIP1 вызывают противовоспалительное действие посредством комплексов SHIP1 / STAT3

РЕФЕРАТ

ВВЕДЕНИЕ

РЕЗУЛЬТАТЫ

IL10 требует, чтобы SHIP1 и STAT3 подавляли продукцию TNFα макрофагами.

IL10 индуцирует физическую ассоциацию SHIP1 и STAT3 в макрофагах

SHIP1 претерпевает конформационные изменения при связывании аллостерического регулятора

Низкомолекулярный аллостерический регулятор SHIP1 ZPR-MN100 облегчает воспаление при IL10

ОБСУЖДЕНИЕ

ВКЛАД АВТОРА

КОНТАКТ ДЛЯ ОБМЕНА РЕАГЕНТАМИ И РЕСУРСАМИ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ И ДЕТАЛИ ОБЪЕКТА

Колонии мышей

Конструкции

Клеточные линии

Выделение перитонеальных макрофагов мышей

Производство макрофагов, полученных из костного мозга

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ МЕТОДА

Культуры с непрерывным потоком

Количественная ПЦР в реальном времени

Измерение продукции TNFα

Иммуноблоттинг

Акцепторный анализ FRET с фотообесцвечиванием

Иммунофлуоресценция

Мышиная эндотоксемия Модель

Колит у мышей Модель

Экспрессия PAC2 для кристаллографии

Экспрессия метки PAC2-Avi для биослойной интерферометрии

Кристаллизация белка, сбор данных, фазирование и уточнение

Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей

Биослойная интерферометрия

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ И СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

НАЛИЧИЕ ДАННЫХ И ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ

КОНТАКТ ДЛЯ ОБМЕНА РЕАГЕНТАМИ И РЕСУРСАМИ

БЛАГОДАРНОСТИ

Добавить комментарий Отменить ответ